耿蕴峰，李晓娜，杨 红，郝晓宏，韩淑琴，杨 涛*

(1.河北省石家庄市第一医院肝胆外科，河北 石家庄 050011；2.河北省体育科学研究所门诊部，河北 石家庄 050011)

·论 著·

DNAJC6异常过表达促进肝细胞肝癌的进展

耿蕴峰1，李晓娜2，杨 红1，郝晓宏1，韩淑琴1，杨 涛1*

(1.河北省石家庄市第一医院肝胆外科，河北 石家庄 050011；2.河北省体育科学研究所门诊部，河北 石家庄 050011)

目的分析热休克蛋白家族成员C6(DNAJC6)表达与肝细胞肝癌患者术后临床资料的关系，探讨DNAJC6在肝细胞肝癌中异常过表达对肝细胞肝癌患者临床分期的影响。方法选取术后病理为肝细胞肝癌的患者102例。应用PCR检测肝癌组织中DNAJC6mRNA的表达量，并与患者的临床数据进行分析。结果肿瘤直径≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表达率低于肿瘤直径>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分级为Ⅰ～Ⅱ级患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分级为Ⅲ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、有无门静脉癌栓、有无乙型病毒性肝炎患者间DNAJC6mRNA高表达率差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝癌组织中DNAJC6异常过表达患者肿瘤直径大、临床分期及临床分级差、预后不良，故DNAJC6可作为肝细胞肝癌患者术前病情及术后效果评估的重要指标。

癌，肝细胞；热休克蛋白质类；肿瘤分期

肝细胞肝癌是最常见的人类恶性肿瘤之一，其发病率在世界各类恶性肿瘤中居第5位，是恶性肿瘤致死的第三大原因。据统计每年有约700 000人死于肝细胞肝癌，同时约有21 000个新诊断的病例。肝细胞肝癌已经成为严重威胁到人类健康的疾病，特别是在我国这样乙型病毒性肝炎高发的国家，肝细胞肝癌的发病率及病死率更是处于世界前列，成为威胁我国人民生命健康的主要恶性肿瘤之一[1-4]。目前对于肝细胞肝癌仍以外科手术切除为主要治疗手段，但因患者病理分期不同，其术后效果差异巨大，故术前进行有效的病情评估，对肝细胞肝癌患者至关重要。由于缺乏特异性的分子标志物，使临床医师对肝细胞肝癌患者的评估手段局限于肝功能及影像学表现，从而使评估的准确性受到了很大影响，因此找到一个特异性较强的分子标记物作为肝细胞肝癌患者术前病情评估的辅助指标，对提高术前评估的准确性有着重要的临床意义。热休克蛋白家族成员C6(DNAJC6)，位于染色体1p31.3上65.37 Mb至65.67 Mb之间的区域。目前研究发现DNAJC6异常表达与多种疾病的发病有关，其中包括帕金森病和精神发育迟滞癫痫等[5-6]。然而，有关DNAJC6在肿瘤发生发展过程中作用的报到有限，前期研究发现在肝细胞肝癌组织中DNAJC6异常过表达，在人肝癌细胞中DNAJC6过表达可以通过诱导上皮-间质转变过程，增加肝癌细胞的侵袭及迁移能力。DNAJC6在肝细胞肝癌的进展过程中发挥着重要作用，DNAJC6异常过表达与肿瘤大小、分期、分级密切相关。因此，认为DNAJC6可以作为辅助肝细胞肝癌患者临床分期的一个重要的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2003年2月—2008年12月于河北省石家庄市第一医院接受肝癌手术的肝细胞肝癌患者102例，获取手术切除的组织样本。102例肝癌组织及30例相邻正常肝组织标本获取后立即放入液氮中冷冻保存。回顾性分析102例肝癌切除术后患者的临床资料。

本研究获得河北省石家庄市第一医院伦理委员会批准。

1.2 临床分组

1.2.1 年龄分组 患者年龄分组以55岁为界，小于55岁为低龄组，大于等于55岁为高龄组。

1.2.2 肿瘤直径分组 患者肿瘤直径分组以肿瘤直径2 cm为界，直径≤2 cm为小肝癌组，>2 cm为大肝癌组。

1.2.3 肝癌分期 以巴塞罗那临床肝癌分期进行分期：0期(极早期：PS评分0分、病灶为单发、肿瘤直径≤2 cm、没有门静脉高压)；A期(早期：PS评分0分、病灶为单发、肿瘤直径任何大小、Child-Pugh A-B； PS评分0分、病灶数目3个以内、肿瘤直径≤3 cm、Child-Pugh A-B)；B期(中期：PS评分0分、病灶数目多发、肿瘤直径任何大小、Child-Pugh A-B)；C期(进展期：PS评分1～2分、病灶侵及门静脉或N1、M1、肿瘤直径任何大小、Child-Pugh A-B；终末期：PS评分3～4分、肿瘤直径任何大小、Child-Pugh C)。本研究将研究对象分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，其中Ⅰ期为0期、Ⅱ期为A-B期、Ⅲ期为C期。

1.2.4 肝癌分级 以肝功能Child-Pugh分级对肝癌进行分级：5～6分为A级，7～9分B级，10～15分C级。本研究将研究对象分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，其中Ⅰ期为A级、Ⅱ期为B级、Ⅲ期为C级。

1.2.5 门静脉癌栓分组 根据患者有无门静脉癌栓将患者分为有门静脉癌栓组、无门静脉癌栓组、无确切依据组。

1.2.6 乙型病毒性肝炎分组 根据患者有无乙型病毒性肝炎将患者分为阳性组、阴性组、临床数据缺失组。

1.3 实时荧光定量PCR分析肝癌组织及癌旁正常肝组织中DNAJC6mRNA的表达

1.3.1 提取肝癌组织及癌旁正常肝组织中总RNA 将组织样本从液氮中取出，取样本100 mg置于研钵中研磨至粉末状，将研磨好的组织粉末中加入QIAzol Lysis Reagent700 μL研磨均匀，然后加入氯仿140 μL抽提、4 ℃离心，吸取上层水相加入100%乙醇1.5倍稀释。吸取样品700 μL加入RNeasy Mini RNA过滤柱中吸附RNA，漂洗及洗脱后加入RNase-free水50 μL离心获取总RNA样本，保存于-80 ℃备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR分析 RT-PCR扩增引物序列:5′-GGAATTCATGAGCCTCCTCGGGA-GCTAC-3′，5′-CCTCGAGATATAAGGGCTTTT-GGCCTTG-3′。内参GAPDH序列:5′-GAAATC-CCATCACCATCTTCCAGG-3′，5′-GAGCCCC-AGCCTTCTCCATG-3′。PCR反应条件如下：预变性阶段95 ℃ 30 s；扩增阶段95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。共行45个循环，收集30 s末荧光信号。qPCR实验基因表达值按照以下方式计算：ΔCt=Ct待测基因-Ct参照基因，基因相对表达值=2-ΔCt。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

肿瘤直径≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表达率低于肿瘤直径>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分级Ⅰ～Ⅱ级患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分级Ⅲ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、有无门静脉癌栓、有无乙型病毒性肝炎患者间DNAJC6mRNA高表达率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 102例肝细胞肝癌患者不同临床病理因素DNAJC6表达比较Table 1 Comparison of the expression of DNAJC6 in 102 patients with hepatocellular carcinoma in different clinical pathological factors (例数，%)

3 讨 论

当今恶性肿瘤已成为威胁人类健康的首要疾病，是人类致死的主要病因。肝细胞肝癌是最常见的人类恶性肿瘤之一，还是恶性肿瘤致死的主要病种。乙型病毒性肝炎是肝细胞肝癌主要的致病因素，我国是乙型病毒性肝炎高发国家，故肝细胞肝癌在我国的发病率处于世界前列，严重威胁着我国人民的生命健康。

对于肝细胞肝癌，当今仍以外科手术切除为主要治疗手段，但是因患者病理分期及致病分子机制的不同，使患者术后的效果差异巨大，因此术前进行有效的病情评估、术后进行有效的分子生物治疗对肝细胞肝癌患者有着重要的意义。现阶段关于肝细胞肝癌发病的分子机制研究多种多样：如早期生长反应因子3(early growth response protein 3,EGR3)可通过对miR-718的负调控，使肝癌细胞的侵袭及迁移能力增强[7]；组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)能够抑制肝癌细胞的分化，诱导其凋亡[8]；肝细胞肝癌患者血清中miRNA-10b-3p表达水平明显增高，并且其表达水平与患者的生存期明显相关[9]；在肝癌细胞中miR-370表达减低，通过上调miR-370可激活AMPK/Sp1/DNMT1信号转导通路，从而导致肝癌细胞的凋亡增加[10]；miR-147在肝癌组织及肝癌细胞中表达降低，在肝癌细胞中过表达miR-147发现肝癌细胞的侵袭及迁移能力明显降低[11]；磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1,PLCE1)在肝细胞肝癌组织及肝癌细胞中低表达，并且其表达水平与肝癌预后指标有负相关性[12]；萨尔样蛋白4(Sal-like protein 4,SALL4)在肝癌组织中表达量明确高于癌旁正常肝组织，miR-33b在肝癌组织及肝癌细胞中表达降低，在肝癌细胞中过表达miR-33b发现肝癌细胞的侵袭及迁移能力明显降低，并且发现SALL4作为miR-33b的靶基因发挥作用[13-14]；Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,Klf4)通过调节miR-31表达影响肝癌细胞的侵袭及迁移能力[15]； 在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中miR-146a可通过肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6,TRAF6)影响肝癌细胞的增殖及侵袭能力[16]；miR-221在肝癌组织中过表达，在肝癌细胞HepG2中抑制其表达，可明显抑制裸鼠移植瘤的生长[17]；MicroRNA-22-3p在肝癌组织及肝癌细胞中表达降低，在肝癌细胞HepG2中过表达MicroRNA-22-3p发现肝癌细胞的侵袭及迁移能力明显降低[18]。证实在肝细胞肝癌发展过程中受到多种分子途径的影响，为肝细胞肝癌的诊断及治疗提供了一定的分子生物学基础。但是目前仍缺乏一种能够准确、系统评估肝细胞肝癌患者术前分期及术后效果的分子标志物。为此，笔者选取102例肝细胞肝癌患者为研究对象，进一步探讨与肝细胞肝癌分期及术后评估相关的分子标志物，最终发现在肝癌组织中DNAJC6表达上调，并且发现在肝癌细胞中DNAJC6过表达可以诱导上皮细胞-间充质转化过程，导致肝癌细胞的迁移及侵袭能力明显增强。

DNAJC6属于进化上保守的DnaJ/Hsp40家族的蛋白质，调节分子伴侣活性从而刺激ATP酶活性。DnaJ蛋白可能有多达3个不同的领域：一个保守的70个氨基酸的J结构域，通常在N末端，甘氨酸、苯丙氨酸(G/F)丰富的地区；一个锌指结构域；富含半胱氨酸结构域。到目前为止证实与DNAJC6相关的疾病包括帕金森病和精神发育迟滞癫痫。结合已得出的实验数据与102例患者的临床病理数据进一步进行统计学分析发现，肿瘤直径≤2 cm患者DNAJC6mRNA高表达率低于肿瘤直径>2 cm患者，肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分期Ⅲ期患者，肝癌分级Ⅰ～Ⅱ级患者DNAJC6mRNA高表达率低于肝癌分级Ⅲ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而不同年龄、有无门静脉癌栓、有无乙型病毒性肝炎患者间DNAJC6mRNA高表达率差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，肝癌组织中DNAJC6异常过表达的患者，其肿瘤直径大、临床分期及临床分级差、预后不良。因此，DNAJC6可作为肝细胞肝癌患者术前病情及术后效果评估的重要指标。

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(本文编辑：赵丽洁)

Overexpression of DNAJC6 promotes hepatocellular carcinoma

GENG Yun-feng1, LI Xiao-na2, YANG Hong1, HAO Xiao-hong1, HAN Shu-qin1， YANG Tao1*

(1.DepartmentofGeneralSurgery，theFirstHospitalofShijiazhuangCity，HebeiProvince，Shijiazhuang050011，China; 2.DepartmentofOutpatient，theSportsScienceInstituteofHebeiProvince，Shijiazhuang050011，China)

Objective To analyze the relationship between DNAJC6 expression and clinical data of patients with hepatocellular carcinoma(HCC), and to explore the effect of DNAJC6 overexpression on the clinical stages of HCC. Methods One hundred and two patients with hepatocellular carcinoma after operation were selected. PCR was used to detect the expression of DNAJC6mRNA in HCC tissues and analyzed with clinical data. Results The DNAJC6mRNA high expression in patients with tumor diameter≤2 cm was lower than that with tumor diameter>2 cm. The high expression rate of DNAJC6mRNA in HCC patients with stage Ⅰ to Ⅱ was lower than that in patients with stage Ⅲ. The high expression rate of DNAJC6mRNA in HCC patients with grade Ⅰ to Ⅱ was lower than that in patients with grade Ⅲ. The difference was statistically significant(P<0.05). There was no significant difference in the expression of DNAJC6mRNA between ages, portal vein tumor thrombus and hepatitis B virus(P>0.05). Conclusion DNAJC6 abnormal expression in hepatocellular carcinoma patients were with larger tumors, poor clinical stage, grade and prognosis, so DNAJC6 can be used as an important index to evaluate the preoperative condition and postoperative outcome in patients with hepatocellular carcinoma.

carcinoma, hepatocellular； heat-shock proteins; neoplasm staging

2017-01-17；

2017-03-27

河北省科技计划项目(16277705D)

耿蕴峰(1980-)，男，河北石家庄人，河北省石家庄市第一医院主治医师，医学硕士，从事肝胆外科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：yangtaopla@163.com

R735.7

A

1007-3205(2017)05-0548-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.012