孙 鹏, 高玉玲, 王金梅, 刘秀娟

(1. 黑龙江八一农垦大学 测试中心, 大庆 163319; 2. 农业部农产加工品质量监督检验测试中心, 大庆 163319; 3. 大庆石化公司质量检验中心, 大庆 163711)

手性流动相添加剂-超高效液相色谱法拆分头孢噻吩对映体

孙 鹏1,2, 高玉玲1,2, 王金梅3, 刘秀娟3

(1. 黑龙江八一农垦大学 测试中心, 大庆 163319; 2. 农业部农产加工品质量监督检验测试中心, 大庆 163319; 3. 大庆石化公司质量检验中心, 大庆 163711)

在流动相中加入手性选择剂羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)实现了用超高效液相色谱法拆分头孢噻吩对映体。所用色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);流动相为乙腈与pH 7.2的12.0 mmol·L-1羟丙基-β-环糊精溶液以体积比80∶20组成的混合液;流量为0.25 mL·min-1。在所选条件下头孢噻吩的对映体获得基线分离,连续测定6次的相对标准偏差不大于2.3%。

超高效液相色谱法; 头孢噻吩; 对映体; 手性流动相添加剂

头孢类抗生素被称为先锋菌素类,其化学结构为在头孢菌素的母核上通过化学方法连接不同的侧链基团而制得的半合成β-内酰胺类抗生素[1]。头孢类抗菌药物以其抗菌谱广、杀菌活力强、耐酸、耐酶、疗效高、毒副作用相对较小等优点而广泛应用于临床[2-4],为人类战胜各种细菌感染作出了极大贡献。

头孢噻吩为第二代头孢菌素,可用于治疗敏感菌所致的尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎、败血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染等[5]。有关头孢菌素类手性药物对映体的分离方法有高效液相色谱法[6-7]、高效毛细管电泳法[8],但已报道的分离方法分离时间长,对分离条件要求苛刻。因此,研究一种快速分离头孢类对映体的方法,为此类手性药物临床安全提供参考非常必要。本工作采用手性流动相添加剂-超高效液相色谱法拆分头孢噻吩对映体,方法简便、快速,而且对了解它们的药理作用、药效以及在临床研究上都具有重要的理论和实际意义。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1290型超高效液相色谱仪,配G4226A型自动进样器、G4212A型二极管阵列检测器(DAD)、G4220A型二元泵、1290保护柱、C.01.05版本Open LAB CDS软件;SK 8200H型超声波清洗机;VORTEX-2型涡旋仪;ML 204型电子分析天平;PE-20型pH计;0.22 μm微孔滤膜。

头孢噻吩溶液:2 g·L-1,称取头孢噻吩(纯度为95%以上) 0.2 g,用流动相定容至100 mL。

羟丙基-β-环糊精溶液(水相):12.0 mmol·L-1,称取羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD) 2.83 g,用水定容至100 mL,用0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH为7.2,过0.22 μm水相微孔滤膜。

有机相:乙腈过0.22 μm有机相微孔滤膜,备用。

甲醇、乙腈均为色谱纯,氢氧化钠为优级纯,试验用水为蒸馏水。

1．2 色谱条件

Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm),柱温为室温;流动相为乙腈与pH 7.2的12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液以体积比80∶20组成的混合液,流量0.25 mL·min-1;进量样10 μL;紫外检测波长230 nm。

1．3 试验方法

按色谱条件对头孢噻吩溶液进行分离。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

头孢噻吩对映体分离色谱图见图1。

图1 头孢噻吩对映体分离色谱图Fig. 1 Separation chromatogram of cephalothin enantiomers

2．2 色谱柱的选择

试验考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)对分离的影响。结果发现:XDB-C18色谱柱对头孢噻吩对映体无法达到基线分离,SB-C18色谱柱为未封端柱,XDB-C18色谱柱为封端柱,这是因为SB-C18色谱柱中裸露的硅羟基增加了对头孢噻吩对映体的手性识别作用,实现了更好的分离。试验选用Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)。

2．3 手性选择剂种类及浓度的选择

试验分别考察了β-环糊精(β-CD)及HP-β-CD对分离效果的影响。结果发现:β-CD对头孢噻吩对映体有手性识别,但不能达到基线分离,HP-β-CD能使头孢噻吩对映体得到很好的分离。这是因为HP-β-CD与头孢噻吩对映体形成新的氢键,增强了HP-β-CD与头孢噻吩对映体之间的作用,进而增加了HP-β-CD与头孢噻吩对映体的手形识别能力。试验选择HP-β-CD为手性选择剂。

试验考察了HP-β-CD的浓度为6～18 mmol·L-1时对分离的影响,结果见图2。

图2 HP-β-CD浓度对分离度的影响Fig. 2 Effect of HP-β-CD concentration on resolution

由图2可知:随HP-β-CD浓度的增大,头孢噻吩对映体的分离度逐渐增加,当HP-β-CD的浓度为12.0 mmol·L-1时,头孢噻吩对映体的分离度最大。试验选择HP-β-CD的浓度为12.0 mmol·L-1。

2．4 流动相组成的选择

流动相比例是影响对映体分离的又一重要因素。试验考察了头孢噻吩对映体分别在甲醇-HP-β-CD溶液体系和乙腈-HP-β-CD溶液体系对分离的影响。结果表明:在甲醇-HP-β-CD溶液体系中,改变流动相的比例,均不能得到很好的分离,故试验选择乙腈-HP-β-CD溶液体系为流动相。试验还考察了乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的体积比不同时对分离的影响。结果表明:当乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的体积比为80∶20时,头孢噻吩对映体获得基线分离。试验选择乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的体积比为80∶20。

2．5 流量的选择

试验考察了流量对头孢噻吩对映体分离的影响。结果表明:流量减慢延长了头孢噻吩对映体与固定相相互作用的时间,可提高分子选择能力,会适当地增大分离度,但流量减慢也会使峰展宽、保留时间延长。兼顾色谱峰形及分离度,试验选择流动相流量为0.25 mL·min-1。

2．6 水相酸度的选择

水相酸度是影响对映体分离的又一重要因素。试验分别考察了水相pH为3.0,7.0,10.0时色谱峰形及保留时间,兼顾色谱峰形及保留时间,试验初步确定pH在7.0附近。试验考察了水相pH在6.4～8.0内对分离的影响。结果表明:头孢噻吩对映体在pH 7.2时,色谱峰形及保留时间均满意。试验选择水相pH为7.2。

2．7 方法的重现性

按色谱条件分离头孢噻吩对映体,连续进样6次,头孢噻吩对映体的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)依次为2.0%,2.3%,说明该方法的重现性良好。

本工作采用HP-β-CD为手性流动相添加剂结合超高效液相色谱法拆分头孢噻吩对映体,操作简单、灵敏度高,1 min内完成对映体的分离,且比手性固定相分离经济、快捷、安全,为头孢类对映体的分离提供了有效的参考。

[1] 姚晔,邓宁,余沐洋.胶束电动毛细管电泳法分离检测5种β-内酰胺类抗生素[J].食品科学, 2011,32(16):253-256．

[2] 侯力慧.痰热清注射液联合头孢菌素治疗慢性支气管炎的临床疗效观察[J].中国医药科学, 2015,5(7):93-95．

[3] 项婕,朱长远.硫酸依替米星与头孢菌素联合治疗老年社区获得性肺炎的疗效评价[J].药物与临床, 2015,53(2):73-75．

[4] 郑国良,周雁玲,蓝海龙,等.头孢菌素相关性尿路可逆性结石的CT表现[J].影响诊断与介入放射学, 2015,24(3):179-183．

[5] 韩凤,杨明娜,丁寅子,等.2011-2013年北京市中关村医院呼吸科头孢菌素类抗菌药物应用分析[J].中国医院用药评价与分析, 2015,15(1):77-80．

[6] 沈静茹,王伟,余学红.新型高效液相色谱流动相手性添加剂法拆分头孢氨苄对映体[J].中南民族大学学报(自然科学版), 2013,32(2):5-8．

[7] 苏立强,李冲,张晓红,等.高效液相色谱流动相添加剂法拆分头孢氨苄对映体[J].药物分析杂志, 2008,28(6):921-923．

[8] 王荣,贾正平,徐丽婷,等.头孢噻吩手性对映体高效毛细管电泳分离[J].分析化学, 2003,31(6):766-766．

UHPLC Separation of Cephalothin Enantiomers with Chiral Mobile Phase Additives

SUN Peng1,2, GAO Yu-ling1,2, WANG Jin-mei3, LIU Xiu-juan3

(1.TestingCentre,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China;2.TestCenterofQualitySupervisionandInspectionofProcessedAgriculmralProductsinDepartmentofAgriculture,Daqing163319,China;
3.InspectionCenterofDaqingPetrochemicalCompany,Daqing163711,China)

Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) was chosen as a chiral selector to be added to the mobile phase to achieve separation of enantiomers of cephalothin by UHPLC. Agilent Poroshell 120 SB-C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm) chromatographic column was used as stationary phase. A mixture of acetonitrile and 12.0 mmol·L-1HP-β-CD solution (pH 7.2), mixed in the ratio of 80 to 20, was used as mobile phase with a flow rate of 0.25 mL·min-1. Under the chosen conditions, good baseline separation of the enantiomers of cephalothin was attained, and giving values of RSD′s obtained from 6 successive determinations no more than 2.3%.

UHPLC; Cephalothin; Enantiomer; Chiral mobile phase additives

10.11973/lhjy-hx201702010

2016-02-01

大庆市科技计划指导项目(szdfy-2015-50);黑龙江 八一农垦大学校内培育课题(XZR2014-17)

孙 鹏(1982-),男,黑龙江海林人,助理研究员,硕 士,主要从事手性药物分析、农产品农药残留、兽药残留检测技术 研究工作。E-mail:byndsunpeng@163.com

O652.63

A

1001-4020(2017)02-0169-03