徐效圣，吴晓菊，陈亚丽

亚临界法提取神香草精油成分及抗氧化活性的研究

徐效圣1，吴晓菊1，陈亚丽2

（1.新疆轻工职业技术学院食品生物技术学院，新疆乌鲁木齐830021；2.中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆乌鲁木齐830011）

采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析亚临界萃取神香草中挥发油的化学成分和相对含量，并探讨其化学成分与神香草特有香气之间的关系，同时进行体外抗氧化能力试验。结果表明，从挥发油中分离出46种化合物，鉴定出其中的30种，占挥发性成分总量的94.29%；挥发油的主要成分有三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）；分析得出三甲基二环[3,3,1]庚烷-3-酮与α-生育酚乙酸酯是神香草精油独特香气的主要成分；神香草挥发油在DPPH自由基和羟自由基的清除作用方面表现出较高的活性。

神香草；挥发油；抗氧化；气相色谱-质谱联用；亚临界萃取

0 引言

神香草是唇形科多年生草本（半灌木），在新疆的北部、内蒙古等地常见[1-2]，其作为维吾尔族民间常用草药，维吾尔语名为“祖法依亚比斯”。《拜地依药书》载：神香草是一种植物的全草，形状与麦加指甲花和野指甲花相似，药用家生神香草，具有消炎平喘、止咳化痰、祛寒止痛、通肝软脾、利尿消肿、消除毒虫之毒、驱除肠虫的作用[3-4]，神香草含有黄酮类、三萜类、烷烃类、甾体类和挥发油等成分[5-6]。

神香草挥发油的提取有2种常用方法，分别是水蒸气蒸馏法和有机溶剂浸提法。水蒸气蒸馏法出油率仅在0.5%～0.7%，产品得率低，而且活性成分破坏多；有机溶剂方式萃取挥发油，在食药等行业中的应用受限。超临界CO2流体萃取法，虽具有很强的优势，但是气体必须在超高压状态下才能够进行萃取加工，制约了其在工业上的应用。而亚临界流体常温常压条件下是气体状态，因而大大降低了生产成本[7]。

试验采用亚临界萃取方式对神香草提取挥发油，从中鉴定出30种化合物。同时设计自由基清除能力试验对其抗氧化活性进行分析，较系统地评价了神香草挥发油成分及其体外抗氧化能力，为神香草的商业化种植、神香草精油的高品质提取加工提供了理论数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

神香草，新疆伊犁地区第65团场种植；神香草挥发油，中国科学院新疆生态与地理研究所提供[7]；无水乙醚、邻二氮菲、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼及其他试剂，均为分析纯。

GCMS-5977型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司产品；722-P型可见分光光度计，北京普析通用有限公司产品；RE-5298型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；亚临界萃取设备，河南安阳晶华油脂有限公司产品。

AL204-IC型电子天平，FSH-2型高速匀浆机，HWS26型电热恒温水浴锅，TGL-10C型高速台式离心机，以及固相微萃取装置和加热蒸馏装置。

1.2 试验方法

1.2.1 亚临界萃取神香草挥发油

将神香草叶和花于40℃条件下烘干处理72 h，烘干后粉碎过筛，取40目的粉末备用。采用亚临界方式提取，详见参考文献[7]。

1.2.2 样品处理及气相色谱-质谱测定方法[8]

样品预处理：采用针式固相微萃取处理（PDMS），使用前于280℃条件下老化30 min，放入样品瓶，于40℃条件下预热10 min，然后在40℃条件下萃取40 min后直接进样，解析3 min。

色谱柱：30 m×0.25 mm，0.25 μm石英毛细管柱；升温程序：60℃保持2 min，以4℃/min升至140℃保持2 min，再以6℃/min升至220℃保持8 min；检测器：FTD；载气：N2；灵敏度：32×10-12AFS；进样量：1.0 μL；分流比：2∶1。

离子源：EI；能量：70 eV；进样口温度：230℃，接口温度：230℃；电子倍增电压：1.5 kV；溶剂延迟：6 min；扫描范围：40～500 u。

1.2.3 风味物质分析方法

用气相色谱质谱联用仪分析鉴定神香草挥发油样品溶液，得到总离子色谱图。经计算检索，同时对目标组分用峰面积归一法进行积分计算，从而得出反应生成的各组分含量，确定神香草挥发油物质的化学成分。

1.2.4 抗氧化活性的测定

（1）DPPH自由基清除能力的测定。参照文献[8-9]方法改进，分别配制质量浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL神香草挥发油及VC溶液，在一系列10 mL比色管中分别加入3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液，然后加入0.5 mL无水乙醇，摇匀并反应30 min，以无水乙醇为参比，测定其于波长517 nm处的吸光度A1；同时用同样方法测定3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL样品液的吸光度A；测定3.5 mL无水乙醇与0.5 mL样品液于波长517 nm处的吸光度A0，以相同质量浓度的VC溶液作阳性对照，所有操作重复测定3次。按照公式（1）计算DPPH自由基清除率。

（2）羟自由基清除能力的测定。参照文献[10-11]方法改进，采用结晶紫法，配制0.05 mg/mL的VC和纯化后神香草挥发油溶液。在中号比色管中加入0.2 mL 0.4 mmol/L的结晶紫，然后加入3 mL pH值4.0的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲溶液，同时添加2 mL 15 mmol/L的FeSO4溶液和相同浓度、体积的H2O2溶液，缓冲溶液定容至10 mL，摇匀后放置30 min，于波长580 nm处测吸光度A0，同时测定不加H2O2时的吸光度Ab。试验组中，加入H2O2之前，加入不同体积纯化后神香草挥发油样品液，测定其吸光度Ax，以相同质量浓度的VC溶液作阳性对照，所有操作重复测定3次。按照公式（2）计算羟自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 神香草挥发油（亚临界萃取）化学成分神香草挥发油的总离子流见图1。

图1 神香草挥发油的总离子流

经仪器所配置的LIB谱库进行检索，化合物通过保留指数进行定性，峰面积归一化法进行定量。经鉴定，神香草挥发油共获得30种化合物。

在上述条件下获得的GC-MS图谱，结合色谱保留规律，与NIST谱图库作对比。

由图1可知，共分离出46个质谱峰，经检索并结合参考相关文献[12]，初步判断出其中30种化合物成分。其中，以含碳、氢、氧的化合物为主，也有少量的物质含有氮等其他原子，包括4种烷烃类化合物（3种环烷烃和1种直链烷烃）、8种萜烯类化合物、4种酯类化合物、8种芳香族醇类化合物、4种酮类化合物、2种酸类化合物、1种生物碱类化合物。神香草挥发油独特的香味即由上述物质呈现。

神香草挥发油的主要化学成分（亚临界）见表1，三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指纹见图2，α-生育酚乙酸酯的特征指纹见图3。

表1 神香草挥发油的主要化学成分（亚临界）

图2 三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指纹

图3 α-生育酚乙酸酯的特征指纹

通过表1，图1和图2分析，其中生物活性比较高的成分有十五烷、β-水芹烯、桃金娘烯醇、乙酸里哪酯、石竹烯、香树烯、G-橄香烯、硬脂酸乙烯酯、α-生育酚乙酸酯、三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮等。

通过峰面积可以判断萜烯、酯酮类化合物是神香草挥发油的主要成分，其含量为三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）。三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮与α-生育酚乙酸酯是神香草精油独特香气的主要成分。

2.2 神香草挥发油对DPPH自由基的清除作用

通过前人的研究成果及DPPH自由基抗氧化物的供氢能力分析，它在有机溶剂波长517 nm处有强吸收[13]。在反应中，体系颜色变得越浅则表示检测物质的抗氧化能力越强。

DPPH自由基清除率与样品液质量浓度的关系见图4。

图4 DPPH自由基清除率与样品液质量浓度的关系

由图4可知，神香草挥发油具有清除DPPH自由基的作用，且随质量浓度增加清除率增大；但与VC这种人工抗氧化剂相比，其清除效果仍然低于同质量浓度的VC。试验表明，神香草挥发油符合随质量浓度增加清除DPPH自由基能力增强的趋势。2.3神香草挥发油对羟自由基清除能力的测定

羟自由基清除率与样品液质量浓度的关系见图5。

图5 羟自由基清除率与样品液质量浓度的关系

试验采用结晶紫作为氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原的状态。由图5可知，随着神香草挥发油质量浓度增大羟自由基清除率也逐渐升高，说明神香草化学成分具有清除羟自由基的能力，但比VC的清除能力低。因此可知，神香草挥发油可以有效清除羟自由基，对人体健康有益。

3 结论

试验以神香草挥发油为底物，使用GC-MS法分析了的其化学成分与含量，并鉴定出30种化合物成分，含量较多的化合物为酯类、烷烃类和萜类，相对含量最高的是三甲基二环[3,1,1]庚烷-3-酮和α-生育酚乙酸酯。祖丽菲亚·吾斯曼等人的研究结果与试验有些差别，从维药神香草超临界CO2流体萃取经GC-MS分析、鉴定出所有34种化合物，其中γ-谷甾醇（31.882%）、二十八烷（19.953%）化合物含量最高。分析其产生较大差别的原因，可能是试验所用的神香草挥发油采用亚临界萃取制得，经文献检索报道较多的为水蒸气提取制得；也可能因神香草的产地和品种不同，导致其挥发油化学成分有所差异。神香草挥发油成分的复杂性，为进一步合理开发利用神香草资源带来一定的优势。

挥发油是含有多种挥发性成分的复杂体系，其抗氧化活性是多种化学成分共同作用的结果。神香草挥发油对DPPH自由基和羟自由基的清除能力有一定影响，但明显略弱于VC；作为一种多用途植物，其富含特有的活性物质及营养成分，具有抗氧化、防衰老、抑菌等多种生理功能，拥有广阔的市场开发潜力和研究价值。目前，报道的文献研究中较多的是化学成分的分析，对于其抗氧化方面报道较少，试验对此部分进行了完善。神香草挥发油相应的生理活性、药理作用尚不明确，还需要进一步研究。

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[12]丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用[M].北京：科学技术出版社，1987：161.

[13]张逸波，郑文杰，黄峙，等.硒杂环化合物SPO清除DPPH和ABTS自由基的光谱学研究[J].光谱学与光谱分析，2010，30（7）：1 866-1 871.◇

Studies on Chemical Components and in Vitro Antioxidant Capacity of Essential from Hyssopus with Subcritical Treatment

XU Xiaosheng1，WU Xiaoju1，CHEN Yali2
（1.College of Food and Biotechnology，Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi，Xinjiang 830021，China；2.Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，Urumqi，Xinjiang 830011，China）

Subcritical extraction followed by GC-MS combined with quantification by peak area normalization method is used to analyze volatile compounds in the fruitbodies of hyssopus.Meanwhile，the relationship between volatile compounds and characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus is explored.Hyssopus antioxidant activities are evaluated by this method.Results show that 46 compounds are identified，accounting for 94.29%of the total volatile compounds from the fruitbodies of hyssopus among which the predominant compounds are trimethylbicyclo[3,1,1]heptane-3-ketone（28.27%），D-alpha-Tocopheryl acetate（16.89%）and vinyl Stearate（7.32%）.Trimethylbicyclo[3,3,1]heptane-3-ketone and D-alpha-Tocopheryl acetate are mainly responsible for the characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus.The hyssopus shows high antioxidant activity，through the elimination of（DPPH）free radicals and hydroxyl radical.

hyssopus；volatile oil；antioxidant activity；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；subcritical extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.039

1671-9646（2017）03b-0043-04

2017-02-20

新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2014I066）。

徐效圣（1983—），男，硕士，讲师，研究方向为食品质量与控制。