温睿

酶法制备大豆肽的工艺研究

温睿

（牡丹江大学生物制药与食品工程学院，黑龙江牡丹江157011）

研究酶法制备大豆肽，碱性蛋白酶优势最大。通过单因素试验，分析研究了酶法水解挤压膨化全脂豆粉提取大豆肽的最佳工艺范围为加酶量1.5%～2.0%，酶解温度50～65℃，酶解时间3～5 h，料液比1∶5～1∶8，pH值8.5～10.5，为响应面分析研究提供了数据依据。

酶法制备；大豆肽；工艺研究

在植物性原料中，大豆蛋白质含量较高。肽是蛋白质的水解产物。大豆肽与大豆蛋白相比，其必需氨基酸组成与世界卫生组织和联合国粮农组织提出理想蛋白质氨基酸组成模式相近[1]。大豆的某些低分子肽类不仅能提供人体生长发育所需的营养，更易被人体消化吸收，又具有改善机体免疫调节、降血压、降胆固醇和促进脂肪代谢的特殊生理功能[2]。此外，大豆肽还具有加热不凝固、流动性好、易溶于水、良好的吸湿性和保湿性等优点。试验主要研究酶解条件下制备大豆肽。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

市售大豆，硼酸、硫酸钾、硫酸铜、三氯乙酸、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、无水碳酸钠，以及NaOH，HCl，H2SO4，Alcalase碱性蛋白酶。

1.1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机、电热恒温水浴锅、低速离心机、微电脑电磁炉、电子分析天平、远红外分析仪、双螺杆挤压杆，以及JJ-1型增力电动搅拌器、PHS-3C型酸度计、20型孔消化炉、KDN-04型蛋白质测定仪、722型分光光度计、快速混合器。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解工艺

大豆挤压膨化→粉碎→配制溶液→调温度→调pH值→加入蛋白酶→离心→取上清液。

准确称取挤压膨化后再粉碎的全脂豆粉50 g，加入适量水配制成一定浓度的溶液，置于恒温水浴锅中开始搅拌，调节温度至反应温度、pH值至反应值，加入一定比例蛋白酶，在反应温度下进行恒温酶解。酶解过程中需要不断进行搅拌，同时通过滴加1 mol/L的NaOH溶液以保持反应体系pH值恒定，反应偏差一般控制在±0.1。达到反应预定时间后，取出酶解液进行离心，以转速4 500 r/min离心20 min。离心后，小心倾倒顶层漂浮油脂，收集中层清液，然后利用10%三氯乙酸调节其pH值至大豆蛋白等电点（pH值4.3），之后将酶解液水浴10 min，使酶活力丧失，再用低温离心机以转速4 500 r/min离心20 min，除去底层沉淀物，即未水解大豆蛋白和其他非溶性物质，倾倒出上清液，记录上清液总体积后装入塑料小瓶中，置于4℃冷藏保存。取部分上清液测蛋白质含量，利用公式（2）计算TCA-NSI值；记录NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法计算水解度。

1.2.2 水解度（DH）的测定

运用pH-stat法：水解度（DH）以水解断裂的肽键数目（H）占总肽键数目（Htot）的百分数来确定，即DH=H/Htot×100%。水解度DH与水解过程中耗碱量成正比，可用耗碱量来表征水解度的大小，记录下不同时间的耗碱量可得酶解进程曲线。计算公式如下：

式中：VNaOH——消耗碱液的体积，mL；

NNaOH——消耗碱液的摩尔浓度，mol/L；

α——α-氨基解离度，1/α=1+10（pH-pK），其中pK值为α-氨基的平均pK值，pH值为反应起始的pH值；

Mp——底物蛋白质的总质量，g；

Htot——单位质量蛋白中的肽键总和（mmol/g），对于某一特定的蛋白质来讲Htot是一个常数，大豆蛋白Htot=7.75 mmol/g。

1.2.3 肽得率的计算公式

取酶解上清液，加入等量的10%三氯乙酸（TCA）溶液，混合振荡30min，离心分离20min（4500r/min），测上清液可溶性氮，计算氮溶指数，也是肽得率。

式中：TCA-NSI——三氯乙酸可溶性氮得率，%；

N1——在10%TCA中可溶性氮含量，mg；

N2——样品中总的氮含量，mg。

1.2.4 水解酶的选择

酶解反应的特点是反应条件温和，然而我国的大豆蛋白酶解技术目前还不成熟，处于起步阶段，与国外的差距较大。目前，大豆方面的研究多使用动物蛋白酶，但其副反应多，效果很一般；植物蛋白酶使用较少，由于其成本高、周期长，越来越多的研究倾向于使用微生物蛋白酶。

试验研究风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶[3]5种酶对大豆蛋白的酶解效果，比较筛选它们的酶活性，并以水解一定程度的水解度描述各酶的大豆蛋白水解能力，从而得出高效、合理、安全的酶种类，这样使之后的酶解工艺和优化工艺更加完善。

1.2.5 Alcalase碱性蛋白酶

试验以酶解温度、底物浓度、pH值、加酶量、酶解时间为考察因素，以水解度（DH）为指标，确定Alcalase碱性蛋白酶水解挤压膨化后全脂豆粉的最适水解条件。

（1）酶与底物比，即加酶量对水解度和肽得率的影响。取6只四颈瓶，分别精确称取50 g挤压膨化后的全脂豆粉，用250 mL水将其溶解，料液比1∶5，酶解温度55℃，pH值9.0，按照E/S为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%添加量分别加入Alcalase碱性蛋白酶，开始水解4 h，直至反应结束。测定水解度及肽得率，确定碱性蛋白酶水解大豆的合理加酶量。

（2）酶解温度对水解度和肽得率的影响。取5只四颈瓶，分别精确称取50 g全脂豆粉，用250 mL水将其溶解，料液比1∶6，将酶解温度分别控制在45，50，55，60，65℃水平下，调节pH值至9.0，按照E/S为2.0%添加量加入Alcalase碱性蛋白酶，开始水解4 h，直至反应结束。测定水解度及肽得率，确定碱性蛋白酶水解大豆的合理酶解温度。

（3）酶解时间对水解度和肽得率的影响。取6只四颈瓶，分别精确称取50 g全脂豆粉，用250 mL水将其溶解，料液比1∶6，酶解温度55℃，pH值9.0，按照E/S为2.0%添加量加入Alcalase碱性蛋白酶，分别水解1，2，3，4，5，6 h，直至反应结束。测定水解度及肽得率，确定碱性蛋白酶水解大豆的合理酶解时间。

（4）料液比对水解度和肽得率的影响。取5只四颈瓶，分别精确称取50 g全脂豆粉，分别将料液比控制在1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8水平下加入不同体积的水，酶解温度55℃，pH值9.0，按照E/S为2.0%添加量加入Alcalase碱性蛋白酶，进行水解4 h，直至反应结束。测定水解度及肽得率，确定碱性蛋白酶水解大豆的合理料液比。

（5）pH值对水解度和肽得率的影响。取5只四颈瓶，分别精确称取50 g全脂豆粉，用250 mL水将其溶解，料液比1∶6，酶解温度55℃，分别将pH值控制在8.0，8.5，9.0，9.5，10.0水平下，按照E/S为2.0%添加量加入Alcalase碱性蛋白酶，开始水解4 h，直至反应结束。测定水解度及肽得率，确定碱性蛋白酶水解大豆的合理pH值。

2 结果与分析

2.1 水解酶的选择

试验研究了5种酶制剂，即中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶活力，以及水解大豆蛋白的能力。

蛋白酶水解的最适pH值和酶解温度见表1，不同酶的种类对短肽得率的影响见图1。

由图1可看出，碱性蛋白酶优势最大，所以试验选择碱性蛋白酶。

2.2 Alcalase碱性蛋白酶水解条件的确定

以水解度和肽得率为指标，研究5种因素各自对水解效果的影响规律，同时确定了响应面的因素水平范围。

表1 蛋白酶水解的最适pH值和酶解温度

图1 不同酶的种类对短肽得率的影响

加酶量对水解度和肽得率的影响见图2。

图2 加酶量对水解度和肽得率的影响

由图2可看出，当加酶量大于1.5%时，随着加酶量的增大，水解度和肽得率明显增加，在响应面试验设计中加酶量水平选择1.5%～2.0%。

酶解温度对水解度和肽得率的影响见图3。

图3 酶解温度对水解度和肽得率的影响

由图3可看出，酶解温度在55℃附近时，水解度和肽得率都有较大值出现。考虑到交互作用，所以在响应面试验设计中，酶解温度选择50～65℃。

酶解时间对水解度和肽得率的影响见图4。

由图4可看出，酶解时间大于2 h，肽得率明显增加；但当酶解时间大于5 h，水解度和肽得率均有明显下降。所以，在响应面试验设计中酶解时间选择3～5 h。

图4 酶解时间对水解度和肽得率的影响

料液比对水解度和肽得率的影响见图5。

图5 料液比对水解度和肽得率的影响

由图5可看出，料液比大于1∶4，短肽得率明显增加；但当料液比大于1∶8，短肽得率呈下降趋势。所以，在响应面试验设计中料液比选择1∶5～1∶8。

pH值对水解度和肽得率的影响见图6。

图6 pH值对水解度和肽得率的影响

由图6可看出，pH值在8.5～10.0时，水解度和肽得率都有较大值出现，所以在响应面试验设计中pH值选择8.5～10.5。

3 结论

试验研究酶法制备大豆肽，碱性蛋白酶优势最大，选择碱性蛋白酶。通过单因素试验，分析研究了酶法水解挤压膨化全脂豆粉提取大豆肽的最佳工艺范围为加酶量1.5%～2.0%，酶解温度50～65℃，酶解时间3～5 h，料液比1∶5～1∶8，pH值8.5～10.5。

此研究，为响应面分析研究提供了数据依据。参考文献：

[1]潘进权，刘耕.大豆多肽研究概况[J].中国调味品，2003（2）：6-10.

[2]陶红丽，朱志伟，江津津.大豆多肽生理活性研究进展[J].食品与机械，2007，23（6）：133-136.

[3]杨晓泉，陈中，黄纪昆.Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究[J].食品与发酵工业，2001，27（1）：18-22.◇

Study on Preparation of Soybean Peptide by Enzymatic Methed

WEN Rui
（Biological Pharmacy and Food Engineering of Institute，Mudanjiang University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China）

In this study，soybean peptides are prepared by enzyme method，and alkaline protease is the best.The optimum range through single factor analysis of extruded full fat soybean meal by enzyme hydrolysis extraction of soybean peptide：enzyme concentration 1.5%～2.0%，temperature 50～65℃，hydrolysis time 3～5 h，ratio of material to water 1∶5～1∶8，pH 8.5～10.5.This study provides the data basis for response surface analysis.

enzymatic preparation；soybean peptide；technology research

TQ936.16

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.033

1671-9646（2017）03b-0023-03

2017-01-23

温睿（1979—），女，硕士，副教授，研究方向为食品科学。