氯硝柳胺联合顺铂对裸鼠肾上腺皮质癌移植瘤的抑制作用

2017-05-08王敏捷胡卫列王尉朱沂赵旭

中国肿瘤临床 2017年7期

王敏捷胡卫列王尉朱沂赵旭

·基础研究·

王敏捷①胡卫列②王尉②朱沂②赵旭②

目的：研究氯硝柳胺联合低剂量顺铂对裸鼠肾上腺皮质癌移植瘤的抑制作用，并探讨其机制。方法：建立SW-13细胞裸鼠移植瘤模型，设对照组、氯硝柳胺组、顺铂组、联合用药组，比较各组终末肿瘤体积、瘤重、生化指标。TUNEL检测移植瘤组织的细胞凋亡率，免疫组织化学法和Western blot检测移植瘤组织Bcl-2、caspase-3的表达。结果：联合用药组的终末肿瘤体积、瘤重低于氯硝柳胺组、顺铂组（均P＜0.001）；顺铂组、联合用药组的白细胞低于对照组（均P＜0.001），顺铂组与联合用药组比较差异无统计学意义（P=0.29）；顺铂组、联合用药组的肌酐、谷丙转氨酶高于对照组（均P＜0.001），顺铂组与联合用药组的肌酐、谷丙转氨酶比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。TUNEL检测显示联合用药组的细胞凋亡率高于氯硝柳胺组（P=0.004）、顺铂组（P=0.005），免疫组织化学法、Western blot检测显示联合用药组中Bcl-2表达较氯硝柳胺组、顺铂组降低（均P＜0.001），caspase-3的表达升高（均P＜0.001）。结论：氯硝柳胺能够增强低剂量顺铂对肾上腺皮质癌生长的抑制作用且不增加毒副作用，可能与影响Bcl-2、cas⁃pase-3表达促进肿瘤细胞凋亡相关。

氯硝柳胺顺铂 SW-13 Bcl-2 caspase-3

肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma，ACC）源于肾上腺皮质［1］，恶性程度高，缺乏有效治疗手段，预后差［2］。顺铂（cisplatin，CDDP）是治疗ACC的常用药物，大剂量应用会诱发骨髓抑制和肾功能损害，并产生耐药性［3］。氯硝柳胺（niclosamide）的分子式为C13H8Cl2N2O4，用于治疗肠道寄生虫病。近年研究发现氯硝柳胺还具有抗肿瘤作用，能够增加肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性［4-5］。本课题组已在体外细胞实验证实氯硝柳胺可以抑制SW-13细胞的增殖，且与顺铂联合应用可增强顺铂对SW-13细胞的毒性作用［6］，为进一步研究氯硝柳胺联和顺铂对ACC的疗效、毒性作用以及作用机制，本研究利用动物模型探讨氯硝柳胺能否在增强顺铂抗肿瘤作用的同时，减少其毒副作用和耐药性，为寻求ACC新的治疗途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 SW-l3细胞购自上海中国科学院细胞库，于37℃无CO2恒温孵箱常规培养，取对数生长期的SW-13细胞制备浓度为1×107/mL的单细胞悬液。1.1.2 实验动物 BAL B/c-nu/nu雌性裸鼠购自广东省医学动物实验中心，SPF级环境下适应性喂养3天后，于右腋下接种SW-13细胞。待移植瘤达肿瘤标准后，去除未成瘤以及瘤体或体质量最小的裸鼠，用随机数字表法进行随机区组分配，分为对照组、氯硝柳胺组、顺铂组、氯硝柳胺+顺铂组（联合用药组），每组裸鼠5只。本研究经广州军区广州总医院医学伦理委员会批准，严格遵循动物实验操作规范和伦理学规范。

1.1.3 试剂 β-actin抗体、Bcl-2抗体、capsase-3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。TUNEL试剂盒、免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤体积、瘤重、血细胞、生化检测裸鼠随机区组分配后，予腹腔注射药物。氯硝柳胺组药物浓度为1 mg/kg，顺铂组为6.25 mg/kg，联合用药组中氯硝柳胺1 mg/kg+顺铂6.25 mg/kg，对照组予以等量生理盐水，注射量0.5 mL，1次/天，连续30天。每天观察裸鼠生长情况，每3天测量1次肿瘤体积。给药30天后，断颈处死裸鼠，剥离瘤体拍照并称重，部分瘤体采用HE染色，显微镜下观察组织形态。在处死前通过眼球内眦静脉采血，对裸鼠的血液样本进行血细胞生化分析。

1.2.2 TUNEL检测部分剥离的瘤体使用4%多聚甲醛内固定，石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化后按TU⁃NEL试剂盒操作步骤检测移植瘤细胞凋亡，室温镜下行DAB染色，直至样本出现棕褐色。每张切片观察6个视野，光镜下观察（×400），结果以6个视野下细胞凋亡率的平均值表示，实验均重复3次。

1.2.3 免疫组织化学法检测制备石蜡切片，经脱蜡、水化，微波抗原修复，按免疫组织化学试剂盒操作指导进行孵育，室温镜下行DAB染色，直至样本出现棕褐色，封片，检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3的相对表达率。结果以随机6个视野下平均光密度（OD）表示，平均光密度=累积光密度/测量区域，实验均重复3次。

1.2.4 Western blot检测取适量肿瘤组织，裂解、12 000 r/min离心5 min。取各组肿瘤组织总蛋白，48 h后使用BCA蛋白检测试剂盒检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3的相对表达率，结果条带使用Image-Pro分析灰度值，β-actin作为内参蛋白，实验均重复3次。。

1.3 统计学分析

数据处理采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，实验组间差异比较采用单因素方差分析或重复测量资料的方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤的生长曲线及组织形态

SW-13细胞皮下接种后第8天共22只裸鼠接种部位出现结节，行随机区组分配。氯硝柳胺、顺铂药物干预前各组肿瘤体积无显著性差异（F=1.436，P= 0.269），药物干预后对照组的肿瘤生长最快，联合用药组生长最慢，各生长曲线之间具有显著性差异（F= 45.198，P＜0.001，图1A）。显微镜下观察细胞形态不一，排列紊乱，核大深染，异型性明显，符合恶性肿瘤特征（图1B）。

图1 各组裸鼠移植瘤肿瘤生长情况及组织形态Figure 1 Xenograft tumor growth and tissue morphology of nude mice in each group

2.2 各组裸鼠移植瘤体积、瘤重、抑瘤率

氯硝柳胺组、顺铂组和联合用药组的终末肿瘤体积和瘤重均小于对照组，氯硝柳胺组、顺铂组和联合用药组的终末肿瘤体积和瘤重与对照组之间比较差异具有统计学意义（均P＜0.001）。联合用药组终末肿瘤体积和瘤重均小于氯硝柳胺组和顺铂组，氯硝柳胺组和顺铂组终末肿瘤体积和瘤重与联合用药组之间比较差异具有统计学意义（均P＜0.001）。氯硝柳胺组的终末肿瘤体积和瘤重与顺铂组比较差异无统计学意义（均P＞0.05，表1）。

表1 各组裸鼠移植瘤的体积、重量、抑瘤率比较（±s）Table 1 Comparison of xenograft tumor volume,weight and tumor inhibition rate(±s)

acompared with the control group,bcompared with the combined drug group

Group Control Niclosamide Cisplatin Combined drug group Tumor volume(mm3) 3 808.0±1 048.69 1 905.8±569.08ab2 099.6±513.30ab652.0±291.13aTumor weight(g) 3.89±1.07 2.03±0.61ab2.32±0.56ab0.69±0.31aInhibitory rate(%) -50.66 45.90 84.04 Inhibitory rate of tumor weight(%) -47.65 40.21 82.14

表2 各组裸鼠的血细胞、生化指标比较（±s）Table 2 Comparison of blood cell count and biochemical indexes±s)

acompared with the control group,b,c,d,e,fcompared with the combined drug group

Group Control Niclosamide Cisplatin Combined drug group RBC(×1012/L) 41.26±0.13 41.60±0.12 41.55±0.15 40.96±0.13 WBC(×109/L) 10.240±0.24 9.700±0.38 8.464±0.32ab8.268±0.07aPLT(×109/L) 235.4±5.22 233.2±11.3 232.0±9.62 229.0±5.92 BUN(mmol/L) 3.10±0.97 2.94±0.74 8.16±0.65ac8.36±0.99aCr(umol/L) 77.0±6.59 73.4±11.50 116.6±7.43ad114.2±4.76aSTB(umol/L) 13.88±1.78 14.14±2.66 23.74±2.48ae22.78±1.56aALT(U/L) 21.4±7.36 22.4±8.04 53.0±3.16af57.4±2.07a

图2 TUNEL检测转移瘤细胞凋亡（DAB染色×400）Figure 2 TUMEL was used to detect apoptosis morphology in xenograft tumor(DAB staining×400)

2.3 对各组裸鼠的血细胞生化指标的影响

顺铂组、联合用药组的白细胞计数较对照组减低，顺铂组、联合用药组的白细胞计数与对照组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001），顺铂组与联合用药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。氯硝柳胺组、顺铂组、联合用药组的红细胞计数与对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05），氯硝柳胺组、顺铂组、联合用药组的血小板计数与对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。顺铂组、联合用药组的尿素氮、肌酐、总胆红素、谷丙转氨酶水平均高于对照组，与对照组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001），顺铂组的尿素氮、肌酐、总胆红素、谷丙转氨酶水平与联合组比较差异无统计学意义（均P＞0.05，表2）。

2.4 各组裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡情况

TUNEL检测结果显示对照组、氯硝柳胺组、顺铂组、联合用药组细胞总凋亡率分别为（5.97±1.92）%、（32.32±2.45）%、（33.19±2.54）%、（55.70±5.68）%，氯硝柳胺、顺铂组的细胞总凋亡率均低于联合用药组，氯硝柳胺组、顺铂组的细胞总凋亡率与联合用药组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001，图2）。

2.5 各组裸鼠移植瘤组织Bcl-2、caspase-3表达情况

免疫组织化学法结果显示Bcl-2、caspase-3阳性表达呈棕黄色。联合用药组Bcl-2的相对表达率较氯硝柳胺组、顺铂组降低，氯硝柳胺组、顺铂组的Bcl-2的相对表达率与联合用药组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001）；联合用药组caspase-3的相对表达率较氯硝柳胺组、顺铂组升高，氯硝柳胺组、顺铂组的caspase-3的相对表达率与联合用药组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001，图3）。

图3 免疫组织化学染色检测裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、caspase-3的表达（DAB染色×400）Figure 3 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of Bcl-2 and caspase-3 in xenograft tumor of nude mice(DAB staining x400)

Western blot检测结果显示联合用药组Bcl-2的相对表达率较氯硝柳胺组、顺铂组降低，氯硝柳胺组、顺铂组的Bcl-2的相对表达率与联合用药组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001）；联合用药组的caspase-3的相对表达率较氯硝柳胺组、顺铂组升高，氯硝柳胺组、顺铂组的caspase-3的相对表达率与联合用药组比较差异具有统计学意义（均P＜0.001，图4）。

图4 Western blot检测裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、caspase-3的表达Figure 4 Expression of Bcl-2 and caspase-3 in xenograft tumor of nude mice detected by Western blot

3 讨论

顺铂被广泛应用于恶性肿瘤，可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，同时也是肾上腺皮质癌的化疗药物之一，但大剂量顺铂诱发的不良反应影响其临床应用［3］。氯硝柳胺通过多个信号通路影响肿瘤细胞的生物学形为［7-9］。有研究报道［5］氯硝柳胺可以阻断埃罗替尼激活的STAT3/Bcl-2/Bcl-X信号通路，抑制埃罗替尼诱导的STAT3磷酸化，逆转头颈癌和非小细胞肺癌对埃罗替尼的耐药性。在三阴性乳腺癌对顺铂耐受的细胞实验中，氯硝柳胺同样可以阻断由放疗激活的STAT3/Bcl-2/Bcl-X信号通路，恢复放疗耐受的三阴性乳腺癌细胞对放疗的敏感性［10］。

本研究通过对裸鼠移植瘤的动态观察发现，各组的生长曲线和终末瘤体积、瘤重的差异均说明联合用药组的抑瘤效果优于单独用药，各药物处理组对红细胞、血小板影响甚微。顺铂组、联合用药组的白细胞、胆红素、谷丙转氨酶、肌酐、尿素氮水平与对照组之间比较差异具有统计学意义，而顺铂组与联合用药组之间比较差异无统计学意义。结果亦显示氯硝柳胺联合低剂量顺铂不仅增强顺铂对肿瘤细胞的杀伤效果，也无明显加重顺铂诱导的肝肾功能等毒副作用，两者的联合应用不是简单抗肿瘤作用的叠加，而是一种协同作用。联合用药组肿瘤细胞凋亡率较氯硝柳胺组和顺铂组升高，表明联合用药的抑瘤作用可能与肿瘤细胞凋亡有关。Bcl-2家族成员在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，是细胞凋亡的负调节因子，保护细胞免于凋亡［11］。caspase家族是凋亡信号转导的共同通路，caspase-3活化是启动细胞凋亡的标志。本研究中的免疫组织化学法和Western blot检测结果均显示联合用药组的Bcl-2蛋白表达水平与单独用药组相比明显下降，而cas⁃pase-3表达较单独用药组增强，说明氯硝柳胺联合顺铂通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和促进凋亡启动蛋白caspase-3的表达发挥促进细胞凋亡的作用，从而抑制裸鼠SW-13细胞的移植瘤增长。

氯硝柳胺可通过Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、Notch、Hedgehog等信号通路产生抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用［12-13］，也可以通过影响EMT相关蛋白的表达抑制肿瘤细胞的侵袭［14］。因此，仍需进一步研究以明确氯硝柳胺联合顺铂抗肿瘤机制。

综上所述，本研究通过动物模型证实氯硝柳胺可以增强低剂量顺铂对肾上腺皮质癌的抑瘤效果，可能与其影响Bcl-2和caspase-3表达相关。氯硝柳胺联合低剂量顺铂避免了单独使用大剂量顺铂而造成的毒副作用，同时也降低了肾上腺皮质癌对顺铂耐药的概率，因此氯硝柳胺联合顺铂有望成为肾上腺皮质癌新的用药方案。

[1]Zhang YS.Diagnosis and minimally invasive treatment of adrenal tumors[J].Chin J Clin Oncol,2016,43(11):471-474.[张玉石.肾上腺肿瘤的诊断及微创治疗[J].中国肿瘤临床,2016,43(11):471-474.]

[2]Rutter CE,Park HS,Corso CD,et al.Addition of radiotherapy to adjuvant chemotherapy is associated with improved overall survival in resected pancreatic adenocarcinoma:An analysis of the National Cancer Data Base[J].Cancer,2015,121(23):4141-4149.

[3]Qin L,Xu T,Xia L,et al.Chloroquine enhances the efficacy of cisplatin by suppressing autophagy in human adrenocortical carcinoma treatment[J].Drug Des Devel Ther,2016,10(5):1035-1045.

[4]Wang MJ,Hu WL.Research progress of antitumor molecular of niclosamide[J].Mordern Medical J,2017,45(1):138-143.[王敏捷,胡卫列.氯硝柳胺抗肿瘤分子机制的研究进展[J].现代医学,2017,45 (1):138-143.]

[5]Kim S,Kang JW,Song X,et al.Role of the IL-6-JAK1-STAT3-Oct-4 pathway in the conversion of non-stem cancer cells into cancer stem-like cells[J].Cell Signal,2013,25(4):961-969.

[6]Wang MJ,Wang W,Zhu Y,et al.Effects and mechanism of niclosamide on proliferation and apoptosis of adrenocortical carcinoma SW-13 cells[J].Guangdong Medical J,2017,38(1):76-82.[王敏捷,王尉,朱沂,等.氯硝柳胺对肾上腺皮质癌SW-13细胞增殖和凋亡的影响[J].广东医学,2017,38(1):76-82.]

[7]Huang M,Zeng S,Qiu Q,et al.Niclosamide induces apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J].Int Immunopharmacol,2016,31(11):45-49.

[8]Weng S,Zhou L,Deng Q,et al.Niclosamide induced cell apoptosis via upregulation of ATF3 and activation of PERK in Hepatocellular carcinoma cells[J].BMC Gastroenterol,2016,16:25.

[9]Chen YX,Ma CL,Zhu HY.Correlation of ER with Bcl-2 in cervical cancer and pre-cancerous lesion[J].Chin J Clin Oncol,2013,40(23): 1427-1430.[陈艳霞,马彩玲,朱红艳.ER Bcl-2在宫颈病变发生中的相关性研究[J].中国肿瘤临床,2013,40(23):1427-1430.]

[10]Liu J,Chen X,Ward T,et al.Combined niclosamide with cisplatin inhibits epithelial-mesenchymal transition and tumor growth in cisplatin-resistant triple-negative breast cancer[J].Tumor Biol,2016,37 (7):9825-9835.

[11]Risberg K,Redalen KR,Sønstevold L,et al.Pro-survival responses to the dual inhibition of anti-apoptotic Bcl-2 family proteins and mTOR-mediated signaling in hypoxic colorectal carcinoma cells[J]. BMC Cancer,2016,16(1):531-539.

[12]Lin CK,Bai MY,Hu TM,et al.Preclinical evaluation of a nanoformulated antihelminthic,niclosamide,in ovarian cancer[J].Oncotarget, 2016,7(8):8993-9006.

[13]Tomizawa M,Shinozaki F,Motoyoshi Y,et al.Niclosamide suppresses migration of hepatocellular carcinoma cells and downregulates matrix metalloproteinase-9 expression[J].Oncol Lett,2015,10(6): 3515-3518.

[14]Vargas DA,Sun M,Sadykov K,et al.The integrated role of Wnt/βcatenin,N-glycosylation,and E-cadherin-mediated adhesion in network dynamics[J].PLoS Comput Biol,2016,12(7):e1005007.

（2016-12-29收稿）

（2017-03-02修回）

（编辑：张亻抿校对：武斌）

Inhibitory effect of combined niclosamide and cisplatin on adrenocortical carcinoma xenografts in nude mice

Minjie WANG1,Weilie HU2,Wei WANG2,Yi ZHU2,Xu ZHAO2

Weilie HU;E-mail:huwl-mr@vip.sina.com
1Department of Urology,No.422 Hospital of PLA,Zhanjiang 524009,China;2Department of Urology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China

Objective:To examine the inhibitory effect and mechanism of niclosamide combined with low-dose cisplatin on adrenocortical carcinoma xenografts in nude mice.Methods:A SW-13 cell transplanted tumor model was first established in nude mice.The nude mice were then divided into the control group,niclosamide group,cisplatin group,and combined drug group.The groups were compared in terms of tumor body volume,tumor weight,and biochemical index.The cell apoptosis rate of the transplanted tumor tissue was detected by TUNEL assay,while Bcl-2 and caspase-3 protein expression in the transplanted tumor tissue was detected by immunohistochemistry and Western blot.Results:The terminal tumor volume and weight of the combined drug group were lower than those of the niclosamide and cisplatin groups(all P＜0.001).The white blood cell count of the cisplatin and combined drug groups were lower than that of the control group(all P＜0.001).Meanwhile,no difference was observed between the cisplatin and combined drug groups(P=0.29).The creatinine and glutamic pyruvic transaminase of the cisplatin and combined drug groups were higher than those of the control group(all P＜0.001),whereas no significant difference was observed in the levels of creatinine and alanine aminotransferase between cisplatin and combined drug groups(all P＞0.05).TUNEL test results showed that the cell apoptotic rate of the combined drug group was higher than that of the niclosamide group(P=0.004)and cisplatin group(P=0.005).Immunohistochemistry and Western blot test results showed that Bcl-2 expression in the combined drug group was lower than those of the niclosamide and cisplatin groups(all P＜0.001),while caspase-3 expression in the combined drug group was the highest among those of other groups(all P＜0.001).Conclusion:Niclosamide can enhance the inhibitory effect of low-dose cisplatin on the growth of adrenocortical carcinoma and has no additional side effects.This enhancement is probably related to the influence of niclosamide on Bcl-2 and caspase-3 expression levels.Niclosamide promotes the apoptosis of the tumor cells by influencing Bcl-2 and caspase-3 expression.

niclosamide,cisplatin,SW-13,Bcl-2,caspase-3