孔祥瑞，杨军，王让剑

福建省农业科学院茶叶研究所/农业部茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355000

茶树叶片精准测色装置构建及在稀有种质鉴别中的应用

孔祥瑞，杨军，王让剑

福建省农业科学院茶叶研究所/农业部茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355000

采用扫描仪、测色器ColorPix和RGB颜色系统建立测色装置，并利用在线工具ColorHexa将色差指标值转换成 CIELab颜色体系参数，对绿、黄、紫色系典型茶树种质进行环向和径向测色法比较分析。结果表明，径向测定法采用单叶多点重复取值与环向测定法中环位取值具有相近叶色表征作用。通过对120个不同叶色种质的径向多点位重复测定和环向中环位测定，2种方法的明度 L*、色差指标值 a*和 b*显著正相关。但是，考虑到使用的简便性与分析效率，提出用环向中环位测定值定义叶色更为合适。对上述 120个供试茶树种质的环向中环位叶色测定值构成的三维散点图进行分析，发现能够将紫红色种质与紫色系种质有效分离，更进一步证明该技术在特异叶色种质精准鉴别中具有实用价值。

茶树；叶色；测色装置；定量描述

茶树作为叶用植物，叶色表型不仅与胞内花青素、氨基酸等重要次生代谢产物的丰富程度直接或间接相关[1-4]，也是品种适制何种茶类的简单评判依据[5-6]。所以，叶色定量描述是茶树资源育种研究的重要组成部分。早期，陈亮等[7]以目测为主，将茶树一芽二叶期的芽叶色泽描述规范为5个等级进行了统一，至今仍作为传统表型分类方法加以利用。之后，随着测色仪在茶树叶色研究中广泛使用，基于仪器测色途径的分类系统略具雏形[8-9]。然而这些分类方法在解释众多茶树叶色变异时仍存在一定的局限性。精细叶色定量描述方法的缺失，给依据叶色表型进行品种甄别和种质精细划分带来了不便[10]。此外，对于特小叶面积和非均色化材料，依赖现有技术更无法实现叶色性状的精准数量分类，一定程度上阻碍了遗传标记等数量遗传学技术在茶树叶色表型性状研究中的有效应用。

本文选取茶树品种和种质资源120个，使用扫描仪、测色器 ColorPix v1.2、RGB色彩系统构成的测色装置，及在线色彩参数转换工具ColorHexa，对供试材料进行基于环向和径向 2种测色部位叶色表型精确数量分类的比较分析。同时，通过花色研究中常用的CIELab颜色体系[11]对测色结果进行评价，试图建立一套高精度测色系统，以期为茶树种质分类中精确量化定义叶色表型和各类作物的叶类病害监控[12-13]、营养监测[14]等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料来源于福建省农业科学院茶叶研究所乌龙茶种质资源圃，2016年春季选取进入一芽三叶期的茶树种质资源120个，共4个色系，其中绿色系40个材料为福鼎大白茶及福云系列群体种，黄色系40个材料为白鸡冠和“白鸡冠（♀）×黄观音（♂）”杂交组合的BC1群体，紫色系为地方群体种，紫红色系2个材料为自发突变枝条扦插植株。

1.2 叶色测定方法

依据杨如新等[9]的分析结果，选取芽下开展的第1叶作为测色材料，用明基扫描仪在软驱 MiraScan 6.2 [7650 series(Q76)]中进行扫描，参数为彩色、1 200 dpi，扫描得到图片在Photoshop CS3中打开，按“视图-显示-网格，编辑-首选项-参考线、网格、切片和记数”的步骤增加网格，以便统一后续测色部位。测色采用 RGB 色彩系统，用 ColorPix v1.2（www.colorschemer.com）进行参数采集，之后经在线工具ColorHexa（http://www.colorhexa.com）将 RGB色彩系统参数转换成 CIELab颜色系统参数，从而对测色结果进行评价。

测色部位的选择有2种方法，一是径向测定法，即由叶基向叶尖方向等距离取5个点进行测定，同时每个点横向重复3次；另一种方法是环向测定法，即在叶面上由叶缘向叶片主脉方向（由外向内）画5个等距离的椭圆，每个椭圆上取4个顶点作为测色点，由叶基开始按逆时针方向测定，取均值后，每1圈代表1个测色部位，共获得类似于第 1种方法的 5个数值。

1.3 数据统计方法

用EXCEL2016对茶树叶片不同测色部位与其明度之间进行线性回归拟合及显著性检验。应用 R3.3.0分析茶树叶色明度和色差指标值的三维散点图。

2 结果与分析

2.1 叶片径向叶色变化

茶树主要有绿、紫、黄三大色系，本文分别以福鼎大白茶、紫鹃、白鸡冠代表3个色系进行叶色测定部位及测定方法的比较分析。

按径向测定法测定福鼎大白茶第 1叶从叶基到叶尖5个点位的L*、a*、b*值（表1），对这些数据分别进行线性回归拟合及显著性检验，同时求得明度等各色差指标值之间的极差，并绘制测色点位与 L*值的线性回归图（图1）。

对另外两个品种进行如上相同分析，并将结果归纳入表1。由表1可知，径向测定中只有紫鹃的a*值由叶基向叶尖与不同部位之间线性回归拟合达显著水平，其余各色差指标值在三大色系的代表性材料上均与测色部位之间线性拟合结果不达显著水平，多呈现为与图1类似的无规律分布。所以，就供试材料而言，径向测定法不能选择任何单一测色点位作为测定L*、a*、b*值的代表性部位。

此外，就单一色差指标值在不同色系中的差异来看，明度值L*在紫色系中差异最大，在黄色系中次之，在绿色系中最小。而a*、b*值虽然也表现出类似的变化规律，但其变幅却相对较小。所以，茶树叶片细胞内的有色体分布可能存在非均一化特征，当采用径向测定法测色时，应以多点位测定的均值作为测色数据。

表1 福鼎大白茶、白鸡冠和紫鹃径向测定不同部位叶色L*、a*、b*值Table 1 The value ofL*、a*、b*in different leaf positions of tea cultivars ‘Fuding dabachai’, ‘Baijiguan’, and ‘Zijuan’by radial direction method

图1 基于径向测定福鼎大白不同部位叶色明度变化趋势Fig. 1 The tendency of brightness in the basal to tip leaves using radial direction method

2.2 叶片环向叶色变化

按环向测定法，仍对福鼎大白茶、紫鹃、白鸡冠为代表的3个色系进行叶色色差指标值测定，所选叶片与径向测定法的叶片一一对应。其中福鼎大白茶的明度值与由外而内测色环位之间呈显著线性相关（图2）。用同样的方法在另外两个品种的环位和环向L*、a*、b*值之间建立线性回归。不同环之间叶色极差与回归显著性水平检验结果归纳见表 2。由分析结果可知，紫叶种和绿叶种的L*值在不同环位之间极差较大，且2个色系均在L*值上线性回归拟合达显著水平（P＜0.05）。而黄叶种，L*值的极差相对较小，a*、b*值的极差却在 3个色系中均为最大，但线性回归不达显著性水平。综上所述，在线性关系中，叶色表型数量的中间环位值近似于各环位均值。因此，选择中间环位测定L*、a*、b*值对茶树叶色代表性更好。

2.3 径向与环向法的叶色测定差异分析

为了深入比较两种测色方法的精确性，对一芽三叶期的120个供试材料取芽下开展第1叶分别用径向法测定15个随机点位的L*、a*、b*均值和用环向测定法测定中间环位的L*、a*、b*值，并对两种方法测得的L*、a*、b*值分别以径向值为横轴，以环向值为纵轴进行拟合，得到两种方法测得L*、a*、b*值的二维散点图，其中角平分线代表横纵坐标值相等，角平分线下方为径向值大于环向值，平分线以上为环向值大于径向值。

图2 基于环向测定福鼎大白茶不同部位叶色明度变化趋势Fig. 2 The tendency of brightness in the basal to tip leaves using circular direction method

表2 福鼎大白茶，白鸡冠和紫鹃环向测定不同部位叶色L*、a*、b*值Table 2 The value ofL*、a*、b*in different leaf positions of tea cultivars ‘Fuding dabai’, ‘Baijiguancha’, and ‘Zijuan’by circular direction method

由分析可知，L*、a*、b*值均对称分布于回归线两侧，3个值在两种方法之间均表现出显著正相关（图3），说明径向法当取色位点扩充到≥15个时，其测色均值与环向测定法的中间环位测色值具有相近的表征作用，但是较后者工作量大，会降低数据采集效率。

再对 120个供试材料用两种不同方法测得的L*、a*、b*值进行汇总分析。由表3可知，径向测定法测得的多点L*、a*均值，其变幅均略大于环向法取中环位测色对应数值，但变异系数近似相等，两种方法之间L*变幅差值最大，为 4.81，而a*、b*变幅差值仅分别为0.41、－0.46。所以，两种测定方法在定义和区分叶色方面具有相近的解析精度，其中径向法只有L*值变幅较宽，在明度测定方面代表性略强，但该测定法工作量大，不便于大规模实验中应用，而相比之下，环向法则更具优势。

图3 茶树径、环法叶色L、a、b值的关系Fig. 3 The correlation between tea leafL*,a*,b*obtained by the radial and circular direction methods

表3 茶树叶色径、环法测定比较Table 3 Comparison of the leaf color values obtained by the radial and circular direction methods

2.4 应用于稀有叶色种质鉴定

经过对两种测定法的比较分析之后，应用较为简易的环向测定法，选取环中位对 120个供试材料的第1叶测色，将L*、a*、b*值用于叶色三维空间作图（图4），在三维空间中，不同叶色供试材料呈现出了成簇分布趋势，而稀有叶色种质呈现为明显的离散点，并远离叶色连续变化趋势线。图中的2个红色离散点代表的品种是2个紫红色特异茶树新种质，其叶片呈色上有别于紫色种紫鹃，是茶树中少见的色种，作为育种亲本或中间材料，有望培育出紫红叶色茶树新品种。

图4 茶树叶色稀少品种以离散点形式出现Fig. 4 The rare tea leaf colors appearing in outer dots

3 讨论

3.1 茶树叶色表型分析的测色装置

在植物花、叶等测色研究中通常采用基于色空间（Color space）的仪器测色法，即利用色差仪在自带特定光源条件下测量色差指标值[15]。但是由于测色仪镜口与茶树叶片大小之间的不对等性，使得在实际操作过程中会出现由于叶面积太小导致近似漏光、单叶多点重复测色难以实现等诸多不足。

使用扫描仪、ColorPix等组件构成的测色装置，却可以避免上述缺点，尤其是在将扫描图片放入Photoshop中进行网格化处理之后，利用软件的放大功能和 ColorPix的高灵敏度特性，在1 mm2的叶面积上几乎可以实现＞300个点的无重复测色操作，这对于特异叶色或花斑叶色材料的鉴定，以及观赏性植物的花色测定、果蔬类叶病监测等均具有实际应用价值。

3.2 测色系统的选择

植物花色研究中，对于色相表型的精确定量描述常采用CIELab颜色系统、孟塞尔颜色系统或 ISCC-NBS色名表示法[16]，其中CIELab颜色系统在现有研究中的应用较多[17-18]。刘东明等[19]用CIELab颜色系统，对茶树绿色、黄绿、紫绿色系的L*、a*、b*值进行比较分析，认为CIELab颜色系统的色差指标值在不同叶色材料间具有一定的分布规律。杨如新等[9]用CIELab颜色系统结合分层聚类法对茶树叶色进行表型数量化分析，成功地将常见茶树叶色表型细分成了7个色系。而本研究中由于测色装置本身限制，色差指标值采集选取的是马铃薯等作物已广泛应用的RGB测色系统[20-21]，后续分析是通过在线工具ColorHexa，将其转换成CIELab颜色系统对应色差指标值完成。由分析结果可知，即便是表型差异较小的紫色系与紫红色系也可以通过本研究中采用的测色装置及其处理方法加以鉴别，说明使用RGB测色系统的测色装置及其配套分析方法与CIELab颜色系统一样[22]，在茶树叶色分类中具有完全相同的表征作用。

3.3 径向与环向测色方法的比较

径向测定与环向测定结果中L*、a*、b*值的显著正相关和单值变幅区间高相似性，使得两种方法在非花斑型叶色情况下可以相互代替。此外，本文环向测定法中的环位取点规则也适用于叶缘变色种质按不同环位进行测色比较鉴定。但是，对于长期人工选育过程中出现的稀有花斑叶色种质或品种则应以特例处理。

茶树叶色测定的研究在于找到一种统一准确的测定规则，只有在严格限定发育时期的前提下，应用统一规则测定叶色，才能获得可靠的茶树叶色值，进而区分相近叶色，发现新种质和原有品种叶色差异，便于比较不同地区茶树种质或品种，利于茶树叶色研究交流，推动茶树叶色研究发展。

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Establishment of Precise Color Measuring Device for Tea (Camellia sinesis L.) Leaf and Its Application in Identification of Rare Germplasm

KONG Xiangrui, YANG Jun, WANG Rangjian

Institute of Tea Reaearch, Fujian Academy of Agricultural Sciences/
Fujian Sub-Center of National Tea Improvement Center, Ministry of Agriculture, Fu′an 355000, Chnina

A tea leaf color measurement system was established by using the scanner, color picker tool ColorPix and RGB color rules. The value of color difference was converted into CIELab color system parameters by the online tool ColorHexa and then the leaf colors of Typical Green, Yellow and Purple tea Germplasms were comparative analyzed through circular direction and radial direction methods. The results showed that the single leaf multi - point repeat value in radial measurement and the mid-ring position value in circular method had similar leaf color characterization. The 120 tea germplasms were randomly selected and measured for the brightness L*and chromatic components a*and b*. The values of lightness L*and color difference a*and b*between the two methods were significantly and positively correlated. However, when the facilitation and the efficiency of analysis were taken into consideration, it is better to use the color value in the mid-ring position by circular direction method. When the leaf color values of 120 germplasms were measured in the mid-ring position to draw the three-dimensional scatter plots, the mauve color group was effectively separated from the purple germplasms, which further proved the efficiency of the method to accurately identify specific leaf color germplasm.

tea plant, leaf color, color measurement device, quantitative description

S571.1；S326

A

1000-369X（2017）02-160-07

2016-12-26

2017-02-06

福建省自然科学基金（2016J01118）、福建省省属公益类科研院所专项（2015R1012-7）

孔祥瑞，助理研究员，主要从事资源育种方面的研究。E-mail: xiangruikong@bioxxx.cn