方洁，李春芳，马春雷，陈亮

中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心，农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

方洁，李春芳，马春雷，陈亮*

中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心，农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPS）是萜类合成途径的结构酶，对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列，分别命名为 CsGGPS1-4和 CsGGPS9，其中 CsGGPS9存在 3条等位基因，分别是 CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3，在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明，茶树 GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域，不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示，CsGGPS1、CsGGPS2和 CsGGPS4定位在叶绿体上，CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模，结合“three-floor”模型对茶树 GGPS家族成员的功能进行预测，预测结果显示，CsGGPS1、CsGGPS2和 CsGGPS4是 GGPS；CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基；CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于 30的异戊烯基焦磷酸。qRT-PCR分析表明，CsGGPS1整体表达丰度较低，仅在一芽二叶中表达量稍高；CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达，在花中表达量最高，且花发育过程中表达量先上升后下降；CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花，花发育过程中表达平稳；CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近，在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同；CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。

茶树；牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶；三维结构模型；表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS）是萜类合成途径的结构酶，它催化烯丙基底物﹝二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP，C5）、牻牛儿基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP，C10）或法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FPP，C15）﹞与活性元件异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP，C5）聚合形成萜类合成前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP，C20）。GGPP进一步在萜类合成下游酶的作用下合成双萜（赤霉素、叶绿醇）、四萜（类胡萝卜素）及多萜化合物。GGPS是异戊烯基焦磷酸合酶基因家族的成员，在植物中以基因家族的形式存在。拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中存在12个预测为GGPS的基因，是GGPS家族成员数目最多的植物。其中，AtGGPS1-4和AtGGPS11经实验验证是真正的GGPS，AtGGPS5为假基因，AtGGPS6、AtGGPS7、AtGGPS9、AtGGPS10为牻牛儿基法 尼 基 焦 磷 酸 合 酶 （ Geranylfarnesyl diphosphate synthase，GFPS）基因，AtGGPS8为聚异戊二烯焦磷酸合酶（Polyprenyl diphosphate synthase，PPPS）基因，AtGGPS12为异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基（Small subunit of geranyl diphosphate synthase，GPS.SSU）基因[1]。为解释 GGPS家族的产物链长决定机制，Wang等[1]结合前人研究成果和拟南芥中酶产物链长不同的GGPS家族成员的晶体结构分析结果提出了“three-floor”模型。在茶树（Camellia sinensis）中 GGPS的研究不多，有报道它参与茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）和紫外线B（Ultraviolet-B，UV-B）处理的响应过程和叶片 白化过 程[2-4]。茶树中 GGPP 导向（GGPP-derived）的萜类化合物对成品茶的品质具有重要影响。茶叶中类胡萝卜素在加工过程中转化为紫罗酮，是茶香气的重要组成部分[5]，叶绿醇作为叶绿素的组分，是绿茶干茶色泽的呈色物质。

本研究通过RACE和RT-PCR方法得到了5条潜在的茶树GGPS序列及其中1条的3条等位基因序列，采用生物信息学方法分析了茶树 GGPS家族的氨基酸序列并预测了其亚细胞定位，利用模拟的蛋白质三维结构和“three-floor”模型预测了蛋白的功能，同时研究了茶树 GGPS在不同组织部位的表达模式，为全面解析茶树GGPS家族成员的生化和生理功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于国家种质杭州茶树圃采集龙井43的一芽二叶（包含芽、第一叶、第二叶等各部分）、成熟叶、幼根、花蕾、半开花和全开花等组织器官。从3株茶树取样作为3个生物学重复，1个样品在每株茶树上取5小份混合，取样后随即放入液氮，然后置于－80℃冰箱中保存备用。

1.2 RACE克隆和基因全长克隆

从转录组数据中筛选出注释为 GGPS的EST序列，根据 Uniprot网站上 Blast结果将其分为ORF完整和不完整的序列。对ORF不完整的EST序列设计特异引物（表1）。采用康为全能型植物RNA试剂盒提取龙井43一芽二叶总RNA，利用Clontech SMARTer RACE cDNA Amplification Kit采取巢式PCR的方式对 ORF不完整的序列进行扩增。将扩增序列与已获得的 EST序列进行拼接，获得具有完整ORF的基因序列。

表1 RACE PCR引物Table 1 Primer sequences for RACE PCR

表2 基因全长克隆引物和荧光定量PCR引物Table 2 Primer sequences for cloning GGPS gene family in tea plant and qRT-PCR analysis

采用 PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA。根据基因序列查找ORF并设计引物验证基因全长（表2）。基因全长克隆反应体系为：Premix PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 25 μL、cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol L–1）各1 μL，加水至终体积50 μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，55℃退火55 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物使用1.2%的琼脂凝胶进行电泳，回收目的基因条带（Axygene AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒），将回收产物连接到T载体上（Takara pMDTM18-T Vector Cloning Kit），转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞（Takara），随后进行菌落PCR鉴定阳性克隆，委托上海华津公司进行测序。

1.3 生物信息学分析

利用测序所得核苷酸序列，通过NCBI ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder）在线工具对序列进行ORF查询，并推导氨基酸序列。在Clustalx 2.0软件中对多序列比对后，利用MEGA 5.2软件输出系统发育树构建结果。利用在线工具ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam）、Pfam（http://pfam.xfam.org）、SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）、TargetP 1.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）等对茶树GGPS的基本理化性质、蛋白质结构域、信号肽和亚细胞定位进行预测。利用Swiss Model（https://www.swissmodel.expasy.org）模拟蛋白质三维结构，并结合“three-floor”模型预测蛋白的功能。

1.4 茶树GGPS家族的组织表达模式分析

提取龙井43一芽二叶、芽、第一叶、第二叶、成熟叶、幼根、花蕾、半开花和全开花的总 RNA。采用 Takara PrimeScriptTMRT Reagent Kit合成cDNA。实时荧光定量PCR试验按照Takara SYBRPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书操作。根据测序得到的基因序列和内参基因GAPDH的序列设计引物，见表2。荧光定量反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上下游引物（10 μmol L–1）各0.8 μL、ROX Dye II 0.4 μL、cDNA 2 μL，加水至终体积20 μL。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃预变性5 s，60℃退火34 s，40个循环；溶解曲线1个循环。每份样品设置 3个技术性重复，采用2-ΔΔCT方法分析基因的表达水平，将CsGGPS1在芽中的表达量设为1，计算茶树GGPS家族成员在茶树各个组织的相对表达量。利用IBM SPSS Statistics 19软件在P＜0.01的条件下对数据进行显著性检验。

2 结果与分析

表3 茶树GGPS基因家族克隆和生物信息学分析Table 3 Molecular cloning and bioinformatics analysis of GGPS gene family in tea plant

2.1 茶树GGPS家族的克隆

用Nanodrop 2000和凝胶电泳检测提取的龙井43一芽二叶RNA的质量，结果显示RNA纯度和完整性符合要求。将RACE克隆得到的序列与EST序列拼接，得到ORF完整的基因序列。以反转录得到的cDNA为模板，利用ORF引物扩增得到目的基因片段，测序验证茶树GGPS家族的ORF长度和编码氨基酸数等信息见表 3。茶树GGPS家族成员的 ORF长度为 936～1 293 bp，编码氨基酸个数为311～430，与拟南芥中同源基因的序列相似性为39%～78%，覆盖度为68%～95%。

2.2 茶树GGPS家族的生物信息学分析

利用MAGE5.2软件以最大似然法对茶树GGPS家族成员和拟南芥GGPS家族成员的氨基酸序列构建系统发育树（图1），除CsGGPS9外茶树中其他 GGPS成员与拟南芥中 GGPS家族成员聚成一支，推测CsGGPS9可能具有与其他成员不同的功能。在聚成一支的茶树GGPS中，CsGGPS1和CsGGPS2与AtGGPS7序列相似性最高，CsGGPS3和 CsGGPS4与AtGGPS6和AtGGPS10的序列相似性最高，在功能上可能有相似之处。然而拟南芥中功能相同的 GGPS并不都聚在一起，所以茶树GGPS家族成员的功能还需进一步分析。

图1 茶树GGPS与拟南芥GGPS家族的系统发育分析Fig. 1 The phylogenetic assay of the amino acid sequences of GGPS family in tea plant andArabidopsis thaliana

图2 茶树GGPS家族的三维结构模型Fig. 2 3D structure models of GGPS family in tea plant

如表3所示，蛋白质理化性质分析表明，茶树GGPS家族成员的分子量在34.2～47.2 kD，理论等电点为5.59～7.14；CsGGPS2、CsGGPS3和CsGGPS4不稳定指数略高，表明蛋白是不稳定的，其余蛋白是稳定的；CsGGPS1和CsGGPS9-2平均疏水性为正值，为疏水性蛋白，其余为亲水性蛋白。蛋白结构域预测结果显示，茶树GGPS都具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域——polyprenyl_synt结构域。除CsGGPS3外，茶树GGPS序列中都含有两个富含天冬氨酸的保守区域 DDx2-4D（The fi rst aspartate rich motif，FARM，x可以是任意氨基酸）和 DDxxD（The second aspartate rich motif，SARM）。茶树GGPS不存在信号肽序列，为非分泌蛋白。亚细胞定位预测结果表示，CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位于叶绿体，而 CsGGPS3和CsGGPS9定位于线粒体。结合 Blast结果和CsGGPS3的氨基酸序列分析结果推测其为构成异源二聚体形式的 GPS的小亚基。CsGGPS2和CsGGPS4存在对异源GPS大小亚基互作必不可少的富半胱氨酸模体 CXXXC（Cysteine rich motif，CRM，x可以是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸或丝氨酸），均定位在质体上，可能是构成异源二聚体形式的 GPS的大亚基。对蛋白三维模型的分析发现茶树 GGPS家族成员的主体由 α螺旋构成（图 2）。同茶树中其他成员一样，CsGGPS3含有10个α螺旋，由于GPS.SSU单独无生化功能，不对其催化功能进行预测。从碳链的叠加图中可以看出 CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4的主体结构非常相似，而CsGGPS9与它们大体结构相似。根据“three-floor”模型，α螺旋D、E和F构成的空穴是GGPS结合烯丙基底物的反应穴，反应穴内三层 floor位点上的氨基酸侧链大小决定产物的链长[1]。CsGGPS1、CsGGPS2、CsGGPS4和CsGGPS9在三层 floor位点对应的氨基酸见表 4。由于CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4在floor1位点存在1个侧链较大的氨基酸Met，故推测其主产物为GGPP，而CsGGPS9在各层floor位点中均不存在侧链较大的氨基酸，推测其主产物是碳链长度大于30的异戊烯基焦磷酸。2.3 茶树GGPS家族的组织表达模式分析

茶树GGPS家族在一芽二叶、成熟叶、幼根和花等组织部位中表达情况显示（图3），茶树GGPS家族成员在各个组织部位中都有表达，表达丰度存在差异。CsGGPS1表达量较低，仅在一芽二叶中表达量稍高；CsGGPS2表达量较高，在花中表达量明显高于其他组织，在花发育过程中表达量先增加后减少；CsGGPS3在叶片和幼根中的表达量高于花，在花发育过程中表达较平稳；CsGGPS4在茶树各组织部位表达量相近，在花发育过程中的表达量变化趋势与CsGGPS2相同；CsGGPS9在幼嫩叶片中的表达量显著高于成熟叶片，而在新梢中芽、第一叶和第二叶的表达量依次升高（图4）。

表4 CsGGPS1、CsGGPS2、CsGGPS4和CsGGPS9在三层floor位点对应的氨基酸Table 4 The amino acids in the site of three floors of CsGGPS1, CsGGPS2, CsGGPS4 and CsGGPS9

3 讨论

图3 CsGGPS家族成员在茶树不同组织中的表达Fig. 3 The expression of CsGGPS gene family in different tissues

图4 CsGGPS9在茶树叶片不同发育阶段的表达情况Fig. 4 The expression ofCsGGPS9in tea leaves of different developmental stages

GGPS利用烯丙基底物和IPP合成GGPP，随后 GGPP可作为植物初生代谢和次生代谢的底物参与合成萜类化合物。GGPP导向的萜类化合物虽然在植物中含量较低，但是它们广泛参与到植物的生长发育过程中。例如赤霉素对植物生长的调节作用，叶绿醇和类胡萝卜素对植物的光合作用至关重要。部分GGPS还可与GPS.SSU结合，调节代谢流从GGPP导向的化合物转向 GPP导向的化合物，如挥发性单萜，进而影响茶树病虫害防御，花发育过程和成品茶的香气。用MeJA和UV-B处理茶树后，GGPS表达上调，说明它可能参与到茶树抵御胁迫的过程中[2-3]。目前GGPS在茶树中的研究十分有限，仅有 1条基因序列（GenBank：KU892076.1）和部分表达数据。本研究克隆得到了5条潜在的CsGGPS家族序列，为全面解析茶树GGPS基因家族的工作奠定了基础，同时综合生物信息学、组织表达模式分析数据和最新的产物链长决定模型对其生化功能进行了预测，对接下来的功能验证工作具有指导意义。

本研究分析茶树 GGPS家族成员的氨基酸序列时发现除属于 GPS.SSU的 CsGGPS3外，各成员都具有两个保守的富天冬氨酸模体FARM和SARM。Tarshis等[6]利用鸟类法尼基焦磷酸合酶的晶体结构推测异戊烯基焦磷酸合酶利用 FARM结合烯丙基底物，而 IPP则是与 SARM结合。这种观点随后流行了很多年，直到带有配合基的异戊烯基焦磷酸合酶的晶体结构被解析出来，研究人员才明确两个ARM通过3个镁离子形成的镁桥与烯丙基底物结合，影响产物链长[7-8]。Wallrapp等[9]研究发现GGPS蛋白三维结构中α螺旋D、E、F构成的反应穴是酶结合烯丙基底物的部位，构成反应穴的螺旋上的氨基酸侧链残基会影响产物的链长。在前人提出的“one-floor”和“two-floor”模型的基础上，Wang等[1]提出了“three-floor”模型。本研究结合这一模型和 Blast结果对除 CsGGPS3外的茶树GGPS家族成员的催化功能进行预测，预测结果显示，CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4由于在floor 1的位点存在侧链残基较大的氨基酸Met，因此催化主产物为 GGPP，是真正的GGPS；而CsGGPS9在三层floor位点的氨基酸的侧链都较小，主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸，结合Blast结果推测其可能是茄尼基焦磷酸合酶（Solanesyl diphosphate synthase，SPS）。SPS的催化产物茄尼基焦磷酸（Solanesyl diphosphate，SPP，C45）是泛醌类中间产物茄尼醇的合成前体[10]。

GGPS的生理生化功能与其组织表达特性和亚细胞定位密切相关。在番茄中，花和果中特异表达的GGPS参与类胡萝卜素的合成，叶片中特异表达的 GGPS参与虫害诱导挥发物(E,E)-4,8,12-三甲基-1,3,7,11-十三碳四烯(TMTT)的合成[11-12]。拟南芥中，定位于线粒体的GGPS1利用GPP合成赤霉素[13]，定位于质体的GGPS11是光合作用的核心，其合成的GGPP被大量用于合成叶绿醇、类胡萝卜素等化合物[14]。本研究推测CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4的催化功能相同，但在茶树各个组织部位的表达丰度存在差异。CsGGPS1的表达量较低，它可能参与了一些特别的代谢过程；CsGGPS2的表达量较高，推测它参与到一些初生代谢的过程中；CsGGPS4表达量在茶树各个组织中数值接近，可能参与一些基本的代谢过程。植物中 GPS.SSU单独无生化功能，它通过与GGPS单体结合，形成异源二聚体形式的GPS，调节植物体内代谢流由GGPP导向的化合物转为 GPP导向的化合物[15]。CsGGPS3在茶树各个组织中均有表达，在花发育过程中表达平稳，它编码的蛋白存在CRM，但不含ARM，结合Blast结果推测其为GPS.SSU，参与GPP导向的化合物的合成。CsGGPS2存在富半胱氨酸模体，定位于叶绿体，基因在茶树的各个组织部位中均广泛表达，尤其在花发育过程中大量表达，与拟南芥中能与GGPS12互作的GGPS11的结构特征、亚细胞定位和基因表达模式相符，推测可能是与GPS.SSU互作的GGPS，参与GPP导向的化合物的合成，如茶树花中的挥发性单萜。CsGGPS4的结构特征、亚细胞定位及基因在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2的相同，但其基因表达量在茶树各个组织中数值接近，推测它不参与 GPP导向的化合物的合成。CsGGPS9在成熟叶中的表达量显著低于幼嫩叶片，而在新梢中芽、第一叶和第二叶的表达量依次增加。CsGGPS9的催化主产物推测为茄尼基焦磷酸，可能参与叶片中电子传递链组分质体醌和泛醌的合成。目前茶树GGPS家族的研究还很浅显，其各个成员的催化功能、在茶树生长发育和抵御胁迫中发挥的具体作用以及调控方式还需进一步探究。

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Molecular Cloning, Bioinformatics and Expression Analysis of GGPS Gene Family in Tea Plant

FANG Jie, LI Chunfang, MA Chunlei, CHEN Liang*

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPS) is a constitutive enzyme in the terpenoid biosynthesis pathway and plays an important role in plant growth. Five putative gene sequences of GGPS were cloned by RACE and RT-RCR, and named as CsGGPS1-4 and CsGGPS9, respectively. Three allelic variants (CsGGPS9-1, CsGGPS9-2 and CsGGPS9-3) were detected for CsGGPS9, and phylogenetic analysis indicated CsGGPS9 was different from the others. Protein sequence analysis revealed that all CsGGPSs had a conserved polyprenyl_synt domain but no N-terminal signal peptide. Subcellular location predication showed that CsGGPS1, CsGGPS2 and CsGGPS4 might be located in chloroplast while CsGGPS2 and CsGGPS4 might be located in mitochondria. The 3D model of CsGGPSs were predicted by Swiss Model and combined with the ‘three floor’ model indicated that CsGGPS1, CsGGPS2 and CsGGPS4 were bona fide GGPS. CsGGPS3 was the small subunit of heterodimer GPS. Although CsGGPS9 shared a similar structure with the others, the main product of it could be isopentenyl pyrophosphatewith chain length longer than 30. The qRT-PCR analysis showed that CsGGPS1 had low expression levels in all tissues except the ‘two and a bud’. By contrast, CsGGPS2 was highly expressed in all tissues with the highest levels in flowers, where in the expression levels increased first and then decreased during flower blooming. CsGGPS3 exhibited higher expression levels in the leaves and tender root than the flower. The expression levels of CsGGPS4 were similar in different tissues, with the same pattern as CsGGPS2 during flower blooming. CsGGPS9 was significantly higher expressed in the young leaves than the mature leaves.

tea plant (Camellia sinensis), geranylgeranyl diphosphate synthase, 3D structure model, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X（2017）02-130-09

2016-09-14

2016-10-28

国家茶叶产业技术项目（CARS-023）、中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

方洁，女，硕士研究生，主要从事茶树资源育种研究。*通讯作者：liangchen@tricass.com