彭江涛, 候新坡, 兰 涛, 毛大梅, 陈志伟, 潘润森, 官华忠

(福建农林大学福建省作物设计育种重点实验室，福建 福州 350028)

水稻苗期耐盐性基因SST分子标记的筛选与应用

彭江涛, 候新坡, 兰 涛, 毛大梅, 陈志伟, 潘润森, 官华忠

(福建农林大学福建省作物设计育种重点实验室，福建 福州 350028)

以水稻耐盐突变体sst为对照，对67个水稻亲本及突变体sst与水稻品种华占的F2群体进行耐盐性筛选，并结合分子标记结果，分析水稻苗期耐盐性基因SST分子标记ID27093、ID27101、ID27118、INDEL1和INDEL2的特异性和准确性.结果表明，分子标记ID27093、ID27101、ID27118和INDEL1的扩增多态性较低；而分子标记INDEL2的扩增多态性较高，为共显性标记，具有较高的特异性，能区分耐盐供体sst与85.07%的供试亲本，且筛选准确率高.因此，分子标记INDEL2标记可以直接用于耐盐性基因SST分子标记辅助育种.

水稻; 耐盐性基因SST; 分子标记; 筛选

水稻(OryzasativaL.)是一种盐碱中度敏感作物，土壤的盐碱化制约着水稻产量的提高[1].目前，我国盐碱化稻田面积约占水稻栽培总面积的1/5，且因工业污染、化肥过量使用及灌溉不合理等因素导致土壤盐碱化日益严重，严重影响到水稻生产安全[2-4].为此，培育耐盐碱的水稻品种对保障我国盐碱地区的水稻产量有着至关重要的作用.

众所周知，传统耐盐育种技术存在育种周期长、选择受环境影响大的缺点.而分子标记辅助选择技术具有选择效率高、准确性强、受环境影响小等优点，已被广泛应用于水稻主要性状的改良，成为一种常用的育种手段[5].官华忠等[6]成功利用分子标记辅助技术选择培育出了优质抗稻瘟病三系不育系金抗1A.桑茂鹏等[7]通过分子标记辅助选择聚合广谱高抗白叶枯病基因Xa21和香味基因fgr，获得双基因纯合且农艺性状优良的优质香型水稻三系不育系株系.

大量的耐盐种质资源的挖掘及相关基因的定位克隆为耐盐性状的分子育种奠定了基础.目前，通过原有种质资源的鉴定和诱变已筛选出许多具有耐盐性的种质资源[8].如来自斯里兰卡地方品种Pokkali，含有4个耐盐QTLs，表现出强耐盐性[9].利用系统选育方法培育的耐盐碱品种辽盐2号，已获大面积推广[10].顾红艳等[11]对津原101的组培后代进行耐盐筛选，获得了早熟耐盐新品种津原85.并已检测到70多个水稻苗期耐盐的主效基因或QTL[12]，其中4个主效基因(DST[13]、OsIPK2[14]、RSS3[15]和SST[16])和1个QTL[17]已被克隆.本实验室研究发现了具有苗期高度耐盐的水稻突变体sst，并克隆了控制该耐盐性状基因SST.该基因位于水稻第6号染色体，是SBP-box基因，因其功能缺失(ORF的第232个碱基缺失，造成移码突变)，从而产生耐盐性[16,18].因此，进一步设计了与水稻苗期耐盐性基因SST紧密连锁的分子标记，通过各品种耐盐性评价、多态性引物筛选并利用F2分离群体中的耐盐单株对多态性引物进行验证，研究这些标记的特异性和准确性，为建立耐盐性分子标记辅助育种体系提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

以从水稻恢复系R401辐射诱变发现的耐盐突变体sst为耐盐对照，粳稻品种日本晴为不耐盐对照，对66个供试水稻亲本进行耐盐性鉴定和分子标记检测(表1).

表1 引物序列

将耐盐突变体sst与水稻恢复系华占杂交，构建F2分离群体，用于验证分子标记辅助选择的准确性.

1.2 方法

用于耐盐鉴定的供试亲本经浸种催芽，播种于塑料托盘中，在12 h光照，27 ℃的光照培养箱中培养.从播种第3 d开始，每天浇150 mmol·L-1的NaCl溶液200 mL，进行盐胁迫，直至不耐盐品种全部死亡.从盐胁迫第15 d开始统计死亡率，每隔4 d统计1次.

1.3 分子标记分析

1.3.1 标记开发 采用3对引物(ID27093、ID27101和ID27118)为分子标记[16].并依据其定位结果，比对日本晴和9311的SST基因附近的序列，寻找InDel位点.利用Primer 3.0设计引物，开发出分子标记引物INDEL1和INDEL2(表1).

1.3.2 DNA的提取 所有亲本各取10株叶片混合，利用SDS大量法提取DNA；F2群体取单株叶片，用SDS小量法提取DNA.具体方法参考段远霖等[19].

1.3.3 PCR扩增和电泳分析 用PCR和聚丙烯酰胺凝胶方法检测该标记在亲本间的多态性.PCR反应体系为15 μL，含2.0 μL 10×Buffer(20 mmol·L-1)，0.2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，1.5 μL引物(5 mmol·L-1)，0.1 μLTaq酶(5 U·μL-1)，2.0 μL模板DNA(20 ng·μL-1)，8.7 μL ddH2O.PCR反应程序94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃(INDEL2为60 ℃)30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，硝酸银脱色，然后拍照并记录结果.

2 结果与分析

2.1 亲本耐盐性鉴定

将耐盐对照突变体sst、不耐盐对照日本晴和66个亲本置于150 mmol·L-1NaCl溶液中处理，第15、20、25 d调查这些亲本对盐胁迫的反应情况.结果表明，第15 d， 33个亲本和日本晴表现一致，均100%死亡，其余33个亲本则出现不同程度的盐伤害(死亡率为71.80%～94.70%)；第20 d，剩余的33个亲本盐伤害加重，其中10个亲本全部死亡；第25 d，耐盐亲本仍表现正常，其它供试亲本均已死亡(表2).说明，耐盐亲本sst表现出强的耐盐性，而其余供试品种均不耐盐.

2.2 苗期耐盐基因SST的分子标记开发

2.2.1 多态性标记的筛选 利用5对分子标记引物(INDEL1、INDEL2、ID27093、ID27101和ID27118)检测水稻突变体sst、日本晴、华占、广占63-4s、Loment和天丰B的多态性.如图1所示，INDEL1和ID27093在亲本间的条带不清晰，特异性不高；标记ID27118仅日本晴和突变体sst具有多态性；标记ID27101能区分突变体sst、日本晴和Loment；INDEL2表现出较高的多态性，并且能区分突变体sst与其它5个亲本(图1).因此，选择标记ID27101和INDEL2对所有供试亲本进行多态性分析.

表2 68个亲本耐盐表现情况

2.2.2 分子标记ID27101和INDEL2在亲本间的多态性 利用分子标记ID27101和INDEL2分别对耐盐供体sst和67个亲本进行PCR检测.结果表明，标记ID27101可扩增出3种带型，多态性较低，有9个亲本(日本晴、佳辐占、GD-7s、Loment、Dular、沈2B、沈3B、沈4B和秀水13)的带型与耐盐供体sst不一致(图2A,B)，仅能把13.43%的供试亲本与耐盐供体sst区分开.标记INDEL2可扩增出2种带型，除了10个亲本(Y58s、M20B、金泰B、吉田B、泸香618B、粤丰B、R402、早恢89、龙恢158和宜香B)的带型与耐盐供体sst一致，其他57个亲本的带型与耐盐供体sst均不一致，能把85.07%的供试亲本与耐盐供体sst区分开(图2C,D).

上述分析表明，ID27101对耐盐基因sst的区分能力较弱，无法区分杂交稻主干亲本与耐盐供体，予以淘汰.而INDEL2具有较高的多态性，能区分多数亲本与耐盐供体，推荐应用于耐盐基因sst的分子标记辅助选择.

1-6依次是：突变体sst、日本晴、华占、广占63-4s、天丰B和Loment.

A，B为ID27101的扩增产物；C，D为INDEL2的扩增产物；1-68依次为表2中亲本顺序.

2.2.3 分子标记INDEL2的准确性验证 建立耐盐突变体sst和恢复系华占的F2群体，播种后利用150 mmol·L-1NaCl溶液筛选获得耐盐单株327株.将这些单株移植于海南三亚，抽穗时，选择分蘖力强、株高适中、穗粒数较多的优良单株73株用于PCR检测.结果表明，分子标记 INDEL2为共显性标记，恢复系华占和耐盐突变体sst的带型具有明显差异，而杂种F1带型则为杂合带型(同时具有双亲的带型)；所检测73个单株的带型均与耐盐突变体sst一致，与恢复系华占有明显区别(图3).为进一步验证标记选择的准确性，对这73个单株的自交种子(即F3株系)进行耐盐性鉴定，结果表明所有株系均表现出耐盐性.这说明分子标记 INDEL2为共显性标记，且对耐盐基因sst的选择率达到100%，能够应用于该基因的分子标记辅助选择.

10为华占，11为耐盐供体sst，12为华占/sst杂交F1，1-9，13-20为华占/sst杂交F2单株.

3 讨论

水稻耐盐性分子标记辅助育种的研究将会有很大发展空间.利用该技术可以加快耐盐品种的培育，以满足市场对耐盐碱品种的需求.水稻耐盐能力鉴定的方法目前主要有发芽指标法、形态伤害评价法和生长量比较法等[20].其中，形态伤害评价法易于操作，故较常被采用.本研究采用的耐盐突变体sst苗期能在150 mmol·L-1NaCl溶液中正常生长，表现出强的耐盐性；而其他67个供试亲本均全部死亡.相较于前人的筛选方法，本方法更简单直接，能满足育种需求.如汪斌等[18]对耐盐突变体sst在播种后14 d进行2次盐胁迫处理，大约需31 d，在育种实践中会产生秧龄过长的缺点.而本研究在播种后第3 d即进行盐胁迫，处理25 d后不耐盐品种全部死亡，故能在适宜的秧龄期(<30 d)筛选到耐盐单株.另外，该耐盐种质来源于早熟恢复系R401，具有较好的农艺性状.因此，该种质可以作为珍贵的耐盐供体在育种中进一步利用.

水稻耐盐性的鉴定受品种的生育阶段和环境影响大[21-22].谢留杰等[23]研究表明，不同品系间耐盐性表现各异，不同时期品系的耐盐性差异明显.郭望模等[24]进一步证实同一水稻品种在种子萌发期相对耐盐，而幼苗期对盐较敏感.陈志德等[25]对108个水稻品种连续2年的耐盐鉴定表明，同一品种苗期耐盐性在不同年份间差异较大，说明水稻资源耐盐性鉴定易受环境影响.为方便苗期耐盐性基因SST的育种应用，利用定位群体的分子标记(ID27093、ID27101和ID27118)和本实验新开发的分子标记INDEL1与INDEL2对突变体sst和供试亲本进行多态性筛选.结果表明定位群体的分子标记在育种亲本中的扩增多态性低，无法满足分子标记辅助育种的要求.而INDEL2为共显性标记，且具有较好的多态性，还能将耐盐供体与85.07%的供试亲本区分开来.同时，分子标记INDEL2对sst/华占的F2群体耐盐单株的选择准确率极高，达100%.因此，分子标记INDEL2可以应用于耐盐基因sst的分子标记辅助育种，特别在该基因分子标记辅助回交育种中，INDEL2能快速鉴定目标单株，进而加快育种进程.

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(责任编辑:吴显达)

Screening and application of molecular marker for salt tolerance geneSSTat rice seedling stage

PENG Jiangtao, HOU Xinpo, LAN Tao, MAO Damei, CHEN Zhiwei, PAN Runsen, GUAN Huazhong

(Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design; Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350028, China)

Molecular markers, INDEL1 and INDEL2, which are linked to salt tolerance geneSSTof rice seedling, were designed. The specificity and reliability of 5 markers, including ID27093, ID27101, ID27118, INDEL1, and INDEL2, were analyzed through screening 67 rice varieties and a F2population from a cross between mutantsstand a rice restorer line Huazhan for salt tolerance, and mutantsstwas used as a salt tolerance control. The results showed that all markers except INDEL2 demonstrated low polymorphism. INDEL2 turned out to be a co-dominant marker with high specificity, and it was able to distinguish from 85.07% of the tested parents and mutantsstwith high screening accuracy. Therefore, marker INDEL2 could be directly used as a molecular marker in breeding for rice seedling salt tolerance geneSST.

OryzasativaL.; salt tolerance geneSST; molecular maker; screening

2016-05-19

2016-07-15

福建省科技重大专项(2013NZ0002-2)；福建省自然科学基金(2012J01091)；福建省教育厅科技计划项目(JA12095).

彭江涛(1991-)，女，硕士研究生.研究方向：水稻遗传育种.Email:1210294180@qq.com.通讯作者官华忠(1977-)，男，副教授.研究方向：水稻遗传育种.Email:bangzhu8@126.com.

S511

A

1671-5470(2017)02-0166-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.008