吴 斌

(福建省水产技术推广总站/福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002)

“新吉富”罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫效果评价上的应用

吴 斌

(福建省水产技术推广总站/福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002)

制备了“新吉富”罗非鱼血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体(McAb)并进行了特性分析，以血清IgM McAb为基础，建立了IgM捕获ELISA检测方法.采用亲和层析法纯化健康“新吉富”罗非鱼IgM，纯化蛋白经SDS-PAGE检测，重链、轻链的相对分子质量分别为75～78、23～25 ku；以纯化的IgM为抗原制备IgM McAb，制备McAb杂交瘤细胞株系3株，分别命名为2H5、2D4、2B11，抗体亚型均为IgM，小鼠腹水效价分别为1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-5，对IgM敏感度测定表明，2H5、2D4、2B11检测灵敏度分别为31.25、125.00、62.50 ng.以抗罗非鱼IgM McAb包被酶标板，建立IgM捕获ELISA检测方法.以无乳链球菌灭活疫苗免疫罗非鱼，受免血清按建立的IgM捕获ELISA方法检测特异性抗体，结果表明，建立的IgM捕获ELISA检测方法可应用于免疫应答抗体水平分析.

“新吉富”罗非鱼; 免疫球蛋白IgM; 单克隆抗体; ELISA检测方法

罗非鱼作为我国主要的淡水鱼养殖品种之一，2006年以来，链球菌病给罗非鱼产业带来严重危机，免疫防治将成为控制该疾病的主要方向.在鱼类的体液免疫应答过程中，免疫球蛋白是重要的免疫效应分子.目前从硬骨鱼类中已经分离到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ、IgT、IgG等[1].IgM是一类存在于所有有颌类脊椎动物中的抗体[2]，其单体由两条轻链(L链)、两条重链(H链)组成，通过连接链将5个单体连接成一个五聚体，相对分子质量为700～850 ku.

为了研究罗非鱼的免疫机制，吴铁军等[3]克隆获得了罗非鱼IgM重链的cDNA，其序列全长1 885 bp，有一个长1 770 bp的完整阅读框，编码588个氨基酸，相对分子质量为41 453.94 u，为罗非鱼IgM重链基因功能的鉴定工作提供了基础数据.黄婷等[4]采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼IgM，并制备其兔抗血清，结果表明，血清IgM重链、轻链的相对分子质量分别为88.0、21.0 ku，由血清IgM制备的兔多抗效价为1∶32 000.由于罗非鱼IgM兔多抗成分复杂，IgM多克隆抗体应用于免疫血清特异性抗体检测存在灵敏度不足、特异性差的问题.因此，制备特异性强的罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)显得尤为重要.目前，尚未见以罗非鱼免疫球蛋白IgM McAb为制剂，建立IgM捕获ELISA检测方法的报道.本试验通过制备罗非鱼IgM McAb，建立血清特异性IgM抗体捕获ELISA检测方法，为罗非鱼疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测以及IgM的结构与功能分析、免疫应答模式研究等建立物质基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 “新吉富”罗非鱼由福建省淡水水产研究所榕桥中试基地提供；Balb/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司.

1.1.2 试剂与培养基 RPMI-1640培养液、HAT培养液、8-氮杂鸟嘌呤、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、Ig亚类鉴定试剂盒购自厦门泰京生物技术有限公司；Hitrap IgM Purification抗体纯化试剂盒购自Pierce公司；TMB显色液、牛血清白蛋白购自Sigma公司；PEG(MW4000)购自Merck公司；BHI、LB等细菌培养基购自北京陆桥公司.

1.1.3 菌株、抗体与细胞株 无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)070717LL、SIP-pET32a重组原核表达工程菌及SIP重组表达蛋白、SIP抗兔多克隆抗体、罗非鱼IgM兔多克隆抗体均由福建省淡水水产研究所水产动物病害防治研究室制备与保存；骨髓瘤细胞SP2/0由第四军医大学组织学与胚胎学教研室提供.

1.2 罗非鱼IgM的分离与纯化

1.2.1 血清的制备 罗非鱼心脏采血，血清置冰箱(4 ℃)过夜，于5 000 r·min-1离心10 min，取上清备用.

1.2.2 IgM的分离纯化 血清经20% PEG6000沉淀后，用HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析，收集第一个峰的组分，用Hitrap IgM Purification精细纯化，SDS-PAGE电泳分析纯化样品.

1.3 罗非鱼IgM免疫小鼠

取8周龄的Balb/c雌性小鼠5只，将纯化的罗非鱼IgM与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，以0.2 mL·只-1腹腔注射免疫小鼠[5]，一免后于第14、28、35天分别用罗非鱼IgM与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫,4免后尾部采血，应用间接ELISA检测方法检测鼠血清效价.

1.4 罗非鱼IgM杂交瘤细胞株的建立与McAb的制备

当免疫Balb/c小鼠血清的效价达到1.0×10-5后，按照文献[5]的方法，应用McAb制备技术，取脾细胞与SP2/0细胞融合，采用间接ELISA检测方法筛选阳性细胞孔，有限稀释法进行单细胞克隆，建立、保存McAb杂交瘤细胞株，并制备McAb细胞株小鼠腹水.

1.5 罗非鱼IgM McAb小鼠腹水效价的测定

McAb小鼠腹水的效价采用间接ELISA检测方法测定.酶标板包被罗非鱼IgM(20 μg·mL-1)；5% BSA封闭；加入以10倍梯度稀释的IgM McAb小鼠腹水，分别设置阳性对照(受免的Balb/c小鼠多抗血清)、阴性对照(未免疫的Balb/c小鼠血清)，于37 ℃温育1 h；加HRP标记的羊抗鼠二抗，于37 ℃温育1 h；加TMB显色液，室温避光显色10～20 min；加终止液，静置10 min；将空白对照调零，用酶标仪检测450、630 nm双波长的光密度(D)；若待测孔的D大于或等于阴性对照孔的2.1倍时为阳性.

1.6 罗非鱼IgM McAb细胞株亚类的鉴定

罗非鱼IgM McAb细胞株Ig亚类鉴定按Ig亚类鉴定试剂盒步骤进行.

1.7 罗非鱼IgM McAb灵敏度的测定

将罗非鱼IgM兔多克隆抗体包被酶标板，IgM按一定倍数梯度稀释，以1 000 ng至1 ng的系列质量作抗原，IgM McAb(15 μg·mL-1)作抗体，采用双抗夹心ELISA检测方法测定McAb对IgM的灵敏度.

1.8 受免罗非鱼血清特异性IgM抗体捕获ELISA检测方法的建立

用抗原SIP蛋白免疫罗非鱼，收集血清用于建立特异性IgM抗体捕获ELISA检测方法.具体步骤如下：将罗非鱼IgM McAb 2H5纯化，以20 μg·mL-1的含量包被酶标板；用5%牛血清白蛋白封闭；加入待测的受免罗非鱼血清(按一定倍数梯度稀释)100 μL,同时设置阴性对照(按一定倍数梯度稀释的正常罗非鱼血清)、空白对照(PBS液)，于37 ℃温育；洗涤后加入SIP蛋白(10 μg·mL-1)，于37 ℃温育；洗涤后加入抗SIP蛋白的兔多克隆抗体(按1∶100稀释)，于37 ℃温育；洗涤后加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗；最后用TMB显色；终止反应后用酶标仪测定450、630 nm双波长的D；测定待测样品的D(P)、同倍稀释的阴性对照样品的D(N)，当P/N≥2.1时判为阳性.

1.9 IgM捕获ELISA检测方法应用于抗体效价的检测

1.9.1 无乳链球菌灭活疫苗的制备 无乳链球菌菌株070717LL在BHI液体培养基中培养至对数生长期时收集菌体，调整菌液浓度至1×108CFU·mL-1，用0.5%甲醛灭活24 h，于5 000 r·min-1离心10 min，重复3次，用超声波破碎菌体，备用.

1.9.2 无乳链球菌灭活疫苗免疫罗非鱼 取质量约80 g的健康“新吉富”罗非鱼，暂养1周后，分为3组，每组50只.第1组为阴性对照组，腹腔注射0.5 mL生理盐水；第2组腹腔注射全菌灭活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌浓度1.0×108CFU·mL-1)，一免后第21天用全菌灭活疫苗浸泡加强免疫(浸泡菌浓度1.0×107CFU·mL-1)；第3组腹腔注射全菌灭活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌浓度1.0×108CFU·mL-1).

1.9.3 受免罗非鱼血清特异性抗体效价的检测 一免后，于第7、14、21、28、35、42天各组均随机取5尾“新吉富”罗非鱼，分离血清，按“1.8”建立的IgM捕获ELISA检测方法进行检测，分析罗非鱼血清中特异性抗体的效价.

2 结果与分析

1:蛋白Marker;2:20% PEG6000;3:HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR洗脱液;4:Hitrap IgM Purification洗脱液.

表1 3株罗非鱼McAb的亚型及其效价

2.1 罗非鱼血清IgM的分离纯化

罗非鱼血清用20% PEG6000沉淀去除了大量杂蛋白，凝胶过滤层析得到进一步纯化，亲和层析得到较纯的IgM，经SDS-PAGE检测，可见75～78、23～25 ku的条带(图1).

2.2 罗非鱼IgM McAb杂交瘤细胞株系的建立

在罗非鱼IgM McAb杂交瘤细胞株系的建立过程中共进行5次细胞融合，融合率均达55.8%以上.检测到阳性杂交瘤细胞孔后，对细胞孔中的细胞进行3次以上的单克隆化，获得3株能稳定分泌McAb的阳性细胞株，分别命名为2H5、2D4、2B11.

2.3 罗非鱼IgM McAb的特性

3株罗非鱼McAb的效价测定、Ig亚类鉴定结果(表1)显示，3株McAb效价均较高.

2.4 罗非鱼IgM McAb的敏感度

根据双抗夹心ELISA方法，应用3株罗非鱼IgM McAb检测IgM，结果(表2)显示，2H5、2D4、2B11检测IgM的灵敏度分别为31.25、125.00、62.50 ng.

2.5 无乳链球菌灭活疫苗免疫的罗非鱼血清特异性抗体效价

应用罗非鱼IgM捕获ELISA检测方法分别检测3组罗非鱼血清的特异性抗体效价，结果(图2)显示：第1组(阴性对照组)血清的效价均小于1∶50；第2组血清首免后第7天的效价为1∶200，第21、28天的效价最高(1∶800)，第42天的效价为1∶200；第3组血清首免后第7天的效价为1∶200，第21天的效价最高(1∶800)，从第28天到第42天，血清效价从1∶400降低到1∶100.

表2 应用3株罗非鱼IgM McAb ELISA检测IgM的灵敏度1)

1)+表示阳性；-表示阴性.

图2 全菌灭活疫苗免疫的罗非鱼血清特异性抗体效价

3 讨论

当前，针对水产养殖鱼类已建立了斑点叉尾鮰、草鱼、欧洲鳗、牙鲆、银鲫、大黄鱼、黄鳍棘鲷、黄鳝、鲈血、美洲黑石斑鱼、乌鳢IgM的分离与纯化方法[4,6-16]，通过蛋白电泳、蛋白质印迹、液相色谱分析等方法明确了这些鱼种IgM重链的相对分子质量为52～79 ku，轻链的相对分子质量为25～29 ku.本试验采用PEG6000沉淀粗提、凝胶过滤层析、亲和层析等步骤获得较高纯度的“新吉富”罗非鱼IgM，重链的相对分子质量为75～78 ku，轻链的相对分子质量为23～25 ku.张小萍等[17]研究表明，尼罗罗非鱼IgM重链、轻链的相对分子质量分别为77、27 ku，与本试验的结果基本相符.

目前，罗非鱼和斑点叉尾鮰[4]，以及草鱼、大黄鱼、黄鳍棘鲷、黄鳝、鲈血、美洲黑石斑鱼、乌鳢IgM的多克隆抗体已经制备[7,11-16]，并应用于鱼类IgM的结构分析.但由于鱼类Ig分子中的糖基具有强免疫原性，能刺激受免疫动物产生大量抗糖基抗体，导致多克隆抗体产生非特异反应；另外制备高度纯化的免疫原技术难度大，残留的杂质也将影响二抗的特异性[8].而鱼类IgM McAb具有抗原决定簇单一、对抗原纯度要求不高、抗原与抗体结合力强、可体外大量制备的优点.因此，制备鱼类IgM McAb并应用于鱼类免疫细胞的鉴定、抗体结构分析、血清流行病学调查、免疫应答水平监测、免疫效果评价等方面，为鱼类免疫学、血清学研究提供了重要工具.目前，草鱼[6]、欧洲鳗[8]、牙鲆[9]、银鲫[10]、尼罗罗非鱼[17]、紫红笛鲷[18]、奥尼罗非鱼[19]等鱼体的IgM McAb已被制备，并广泛应用于鱼类免疫学研究.本试验制备出“新吉富”罗非鱼IgM McAb，并初步应用于罗非鱼免疫血清的特异性抗体检测与疫苗免疫效果分析，在后期的工作中，有必要应用蛋白质印迹、B细胞定位等方法，明确所制备的McAb针对的罗非鱼IgM抗原决定簇和表位结构，以进一步应用于罗非鱼IgM结构和功能的分析，以及罗非鱼病原诊断、免疫机理研究.

应用本试验制备的罗非鱼IgM McAb检测IgM的灵敏度，可以用IgM直接包被酶标板的间接ELISA方法检测，也可以用IgM多克隆抗体捕获IgM，再进行间接ELISA检测.本试验使用的方法可以避免在IgM直接包被的过程中，抗原包被不完全而造成检测数据误差的状况；同时在罗非鱼血清样品的特异性抗体检测中，由于待测血清未经过纯化，成分中除了IgM，还有其他复杂的细胞因子成分，使用捕获ELISA检测方法可有效地排除血清中的非特异性成分对检测过程的干扰.

为了寻找合适的免疫途径，本试验应用捕获ELISA检测方法对用不同方式免疫的受免疫罗非鱼的抗体水平进行了评估.结果表明，采用注射、浸泡2种免疫方式的罗非鱼在浸泡加强免疫后，血清特异性抗体的效价不仅在高水平上维持的时间长，且第28～42天的特异性抗体表达水平均比单独采用注射免疫的高，能让受免罗非鱼鱼体保持更持久的抗体水平，有利于延长疫苗免疫的保护期并提高保护率.

致谢：感谢福建省淡水水产研究所张新艳高级工程师、郑磊工程师在本研究中给予的帮助和支持.

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(责任编辑:施晓棠)

Preparation of McAbs against immunoglobulinin fromOreochromisniloticusand its application in immune effect analysis

WU Bin

(Fujian Provincial Fishery Technical Extention Center/Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To prepare effective monoclonal antibody (McAb) against serum immunoglobulin (Ig) of tilapia, antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted, and Ig of healthyOreochromisniloticuswas purified by protein A affinity chromatography to characterize its immunological feature. Then purified IgM was used as antigen to immunize Balb/c mice. SDS-PAGE analysis showed that molecular weight of tilapia Ig heavy chain and light chain was 75-78 and 23-25 ku, respectively. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) were obtained and named 2H5, 2D4, and 2B11, with the common isotype being IgM. And titers in the ascites of Balb/c mice were 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-5, respectively. Sensitivities of McAb against tilapia IgM was high, with detection limits being 31.25, 125.00, and 62.50 ng, respectively. Furthermore, MAC-ELISA showed that specific antibody was detected within tilapia immuned byStreptococcusagalaciateinactivated vaccine.

Oreochromisniloticus; immunoglobulin; monoclonal antibody; ELISA

2016-06-22

2017-01-16

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-49)；福建省公益类科研院所专项(2014R1002-3)；福建省海洋与渔业厅重点项目(闽海渔合同[2010]2-12号).

吴斌(1978-)，男，高级工程师，硕士.研究方向：水产动物病害分子免疫学.Email：wubinfire@126.com.

S948

A

1671-5470(2017)02-0187-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.011