梁克伟, 李 明, 王 猛

(中国刑事警察学院， 辽宁沈阳 110035)

新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现指纹技术对脱落细胞DNA提取的影响

梁克伟, 李 明, 王 猛

(中国刑事警察学院， 辽宁沈阳 110035)

采用痕迹检验鉴定技术公安部重点实验室新开发的新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现非渗透性客体表面的指纹，对指纹中脱落细胞的DNA进行提取，实验结果表明新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现指纹后脱落细胞DNA提取成功率明显优于传统的粉末方法。

DNA; M48磁珠提取DNA法; 指纹; YVO4:Eu纳米荧光材料

0 引言

人类的指纹具有明显的个体特征,除少数没有指纹的人,指纹将一生不变,可以广泛应用于刑事案件和身份管理等领域。指纹提取包括:显现指纹、找到特征点、保存数据和比对,其中显现清晰的指纹是最关键的步骤。痕迹检验鉴定技术公安部重点实验室新开发的新型YVO4:Eu纳米荧光材料，应用于一系列常见的光滑非渗透性客体以及某些渗透性客体表面汗潜手印的显现。通过紫外灯照射观察，显现的纹线清晰连贯、细节特征明显、对比反差强烈，其显现效果没有受到背景花纹图案的干扰，保证了手印显现的高灵敏度[1]。

现代实验研究显示： 由于摩擦和接触，指纹中也存在表皮脱落细胞,有报道称人体手掌只要在非渗透性载体上接触超过5秒钟,就会有脱落细胞遗留。传统的指纹显现方法显示指纹后由于显现的颗粒大小对于后期DNA提取有不同程度的影响,而先提取指纹中的脱落细胞擦拭过程中又会破坏了指纹纹理，现场勘查人员常常进退两难，在办案中需要找到一种既能显示指纹又能对后期提取DNA影响较小的技术方法，以解决实战需要。本实验先用YVO4:Eu纳米荧光材料显现非渗透性客体表面的指纹，然后对指纹中脱落细胞DNA进行提取，结果显示新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现指纹后提取DNA明显优于传统的荧光粉末方法。

1 实验部分

1.1 实验样本采集

在非渗透性客体载玻片上指纹捺印样本105份，每位参试者将手洗干净后自然晾干，在干净的载玻片表面按捺两枚新鲜的汗潜指纹，指纹力度保证能够做出DNA,待用。用干净的鹳毛刷(必须一次性使用，而且不能重复使用防止交叉污染)蘸取微量新型YVO4:Eu纳米荧光材料粉末，在客体表面可能有手印部位轻微扫动，出现手印纹线后，弹掉毛刷上多余的粉末，顺着纹线的流向刷显至纹线清晰为止。将显出的手印样品置于暗箱式紫外分析仪中观察、拍照记录，再用指纹胶带纸提取固定[1]。

受试者另一份指纹末显现直接用棉签擦拭提DNA做对比实验，结果见图1。

图1 使用YVO4:Eu纳米荧光材料显现玻璃客体表面汗潜手印照片：其中(a)为明场照片；(b)为紫外光照射下的暗场照片

1.2 主要试剂与仪器设备

M48磁珠DNA提取试剂盒(德国QIAGEN)；2 mg/mL蛋白酶K溶液(冰冻保存)；Identifiler®Plus Kit试剂盒(美国ABI公司)；9700型扩增仪(美国ABI公司)；3130XL型基因分析仪(美国ABI公司)。

1.3 M48磁珠法方法提取DNA

每份实验对象指纹检材分别取YVO4:Eu纳米荧光材料粉末显示和未显示各1份，分别放入0.5 mL离心管中，离心管加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K溶液(冰冻保存，10 mg/mL)，漩涡震荡15 s，保证样本与裂解液充分混匀，56 ℃恒温烘箱水浴中消化2～3 h(期间取出震荡5次)；高速离心机13 000 r/min离心3 min；转移上清液到1.5 mL离心管中；加入1 mLMTL和30 μL磁珠，混匀，置于磁力电动搅拌架上摇匀吸附15 min；然后磁力架吸附磁珠，弃去上清液后加入500 μL LMW1溶液摇匀，磁力架吸附磁珠去上清；加入500 μL80%的乙醇溶液摇匀，磁力架吸附磁珠去上清；重复75%乙醇洗涤2次，磁力架吸附磁珠弃上清；将离心管开盖置于65 ℃加热块上烘干；加入20 μL超纯水混匀磁珠，65 ℃加热10 min，期间震荡2～3次；将离心管置于磁力架上吸附磁珠，取上清液置于新管中4 ℃保存待扩增用[2]。

1.4 STR扩增及产物检测

将上述两种方法提取的模板DNA分别取适量DNA，用Identifiler®Plus Kit试剂盒试剂，PCR反应体系9+1 μL进行扩增，扩增产物3130XL型基因分析仪进行电泳[2]，STR对照样本和显示样本STR分型图谱分别见图2和图3。

图2 对照样本检材DNA分型

图3 YVO4:Eu纳米荧光显现后检材DNA分型

2 结果与讨论

2.1 结果

105例受试者未显现指纹经M48磁珠法直接提取DNA获得了STR分型；新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现后的指纹经M48磁珠法也获得了STR分型，统计结果见表1。

2.2 讨论

我们以前曾经研究发表过(详见参考文献5)常见的金粉、银粉和磁粉显现后对指纹中脱落细胞DNA提取的影响研究，虽然常规的物理粉末显现方法不会破坏细胞，但是由于上述3种粉末直径比较大，消化提取DNA时由于一部分粉末覆盖了脱落细胞导致无法充分消化， DNA测序峰值每次结果不稳定，常常表现为大片段基因座位点容易丢失，公安实战中操作难度较大[5]。从表1中我们可以看到未显现指纹和显现指纹都有STR分型，说明本实验所选的非渗透性客体(载玻片)显现的和未经显现的对照的指纹捺印样本，经过M48磁珠法提取DNA都能够获得STR分型结果，由此可见，新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现该类检材未对检材的DNA含量及检出造成影响。但是表中全部显示基因位点(16个基因座)在成功率(比率)上略有差异，未显现指纹(对照组)有10例未能显示全部基因座可能是受试对象按压指纹时分泌脱落细胞个体差异，纳米荧光材料显现后的指纹(实验组)有15例未显示出全部基因座，我们分析除个体因素影响外，可能是由于操作原因，未能全部捕获脱落细胞，YVO4:Eu纳米荧光材料显示完指纹后收集脱落细胞的实验方法还有待改进。

表1 105例脱落细胞样本显示与未显示 指纹DNA提取成功率比较

从DNA测序仪图谱的峰值结果来看(见图2和图3)，经过新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现检材样本DNA的含量比较未经显示的对照样本没有明显差异，峰值略低有可能是YVO4:Eu纳米荧光材料本身提取DNA时占用了消化体积,导致模版相对浓度降低。

通常认为紫外灯的照射破坏了细胞中DNA的结构，导致PCR扩增模板碱基形成嘧啶二聚体(TT、CC和CT)，影响了DNA复制[6]，但是本研究由于指纹中脱落细胞被YVO4:Eu纳米荧光材料覆盖，遮挡了紫外线的照射，所以未发现对DNA模版的影响(虽然纳米材料覆盖了指纹中的脱落细胞，但显示指纹后仍要尽量减少紫外线照射的时间)。在实验中为了获得理想的STR分型，提取阶段尽量避免细胞的丢失，尽可能收集载玻片上YVO4:Eu纳米荧光粉末放入1.5 mL离心管中(先把载玻片粉末用干净毛刷转移到称量纸上，然后把称量纸折叠缓慢加入离心管中)。按照扩增试剂盒规定DNA模板为1 μL，电泳结果峰值很低[4]，建议改为2 μL，扩增循环次数通常为28次，建议增加两个循环，达到30个循环次数，但是增加PCR扩增循环次数不宜过多，因为循环次数的增加意味着杂带几率的增加。

手印粉末显现法原理是利用手中的汗液、油脂等遗留物质有电负性和黏性，与粉末之间形成较强的物理性吸附力，由于手印遗留物质上吸附了粉末，潜在手印纹路得以显现出来[3]。采用YVO4:Eu纳米荧光材料显现手印，如图所示红色荧光增强手印和客体背景之间的对比，进而在很大程度上提高手印显现的灵敏度。另外，YVO4:Eu纳米荧光材料与传统的粉末显现指纹方法比较具有颗粒粒径小、比表面积大、吸附能力适宜等特点，能够促进手印物质与纳米粉末之间的吸附[1]，这种吸附也把脱落细胞(DNA)进行了包裹。传统的粉末显现指纹方法粉末颗粒粒径较大，不利于DNA提取[5]。通过本实验结果显示：经过新型YVO4:Eu纳米荧光材料显现的指纹样本仍可以考虑通过DNA检验获得理想的STR分型，尤其对于非渗透性客体，如果显示指纹得到的个体特征点不够，便无法利用指纹检验技术比对嫌疑人，这时可考虑利用DNA数据库比对嫌疑人或认定嫌疑人，把指纹和DNA两大个体识别技术联合起来应用，对于实际办案固定犯罪证据链，最大限度开发现场物证的侦查价值具有非常重要的意义。

[1] 王猛.YVO_4:Eu纳米荧光材料的合成及其在手印显现中的应用[J].光谱学与光谱分析，2015(6)：25-26.

[2] 高婧宇，梁克伟，等.“502”胶显现指纹后对脱落细胞DNA提取的影响研究[J].中国刑警学院学报,2014(6)：52-53.

[3] 张书杰.痕迹检验学[M].北京：中国人民公安大学出版社，2007：106.

[4] 郑秀芬.法医DNA分析[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002：26.

[5] 李鹏飞，梁克伟，等. 纸张上汗潜指纹粉末显现后粉的量和种类对DNA提取影响研究[J].中国人民公安大学学报(自然科学版)，2013(4)：8-11.

[6] HELLANI A, COSKUS S, BENKHALIFA M, et al. Multiple displacement amplification on single cell and possible PGD applications[J]. Molecular human reproduction, 2004, 10(11): 847-852.

(责任编辑 陈小明)

中国刑事警察学院痕迹检验鉴定技术公安部重点实验室2015开放课题研究成果。

梁克伟 (1967—)，男，辽宁沈阳人，副教授，博士。研究方向为法医DNA和司法精神病鉴定。

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