李 健，魏洪涛*，张国利，岳玉环，吴广谋，田 园，邱丽娜，马洪圆，王冬冬，吉元刚

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科，吉林 长春130033；2.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所；3.吉林农业大学生命科学学院)

舌癌CAL-27细胞GnRHR的检测及曲普瑞林对细胞增殖抑制作用研究

李 健1，魏洪涛1*，张国利2，岳玉环2，吴广谋2，田 园2，邱丽娜1，马洪圆3，王冬冬2，吉元刚3

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科，吉林 长春130033；2.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所；3.吉林农业大学生命科学学院)

目的 研究I型促性腺激素释放激素(GnRH-I)类似物(GnRHa)曲普瑞林(Triptorelin)对人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株的体外增殖抑制作用。方法 利用RT-PCR方法检测CAL-27细胞株GnRHR mRNA。Western Blot法检测CAL-27细胞表面GnRHR蛋白表达。通过CCK-8法检测曲普瑞林对CAL-27细胞的生长抑制作用。结果 经RT-PCR法检测显示CAL-27细胞存在GnRHR mRNA。Western Blot结果显示， CAL-27细胞蛋白在60 kDa处存在GnRHR特异性反应条带。CCK-8检测结果显示，曲普瑞林对CAL-27细胞抑制率呈现浓度依赖性，且差异显著(P<0.01)。结论 舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株中GnRHR基因及蛋白呈阳性，曲普瑞林对CAL-27细胞增殖具有抑制作用。

曲普瑞林；促性腺激素释放激素受体；舌癌

(ChinJLabDiagn,2017,21:0475)

40%的头颈部恶性肿瘤发生于口腔[1]，目前手术治疗仍是主要的治疗方式[2]。尽管联用包括放化疗在内的多种治疗方法，但预后仍然较差，5年生存率不到50%[3]。有学者研究发现口腔癌根治性治疗对患者生活质量有显著的影响[4]。促性腺激素释放激素(GnRH)是一种由下丘脑分泌的十肽激素，其调控垂体分泌促性腺激素的作用众所周知。然而在过去的三十年中，逐渐发现GnRH及其受体除在垂体以及生殖系统存在，还存在于多种肿瘤组织中[5]。GnRH及合成的GnRH类似物已被证实对多种恶性肿瘤有抑制增殖的作用，包括卵巢癌、乳腺癌，子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌等[6-11]。近年来，Cheung LW的研究显示肿瘤细胞表面GnRHR与肿瘤的转移及血管生成有关[12]。Lu等发现，胃癌组织中GnRHR的表达量与预后显著相关[13]。 这些均提示我们GnRH及GnRHR在肿瘤组织中的表达具有重要意义。迄今，尚未发现国内外关于人口腔癌细胞或组织表达GnRHR的报道，本课题组检测了人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株GnRHR的基因及蛋白表达情况，并利用曲普瑞林针对GnRHR进行了细胞增殖抑制试验，以期为提高口腔癌预后提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株购自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂、材料及仪器 曲普瑞林(Triptorelin，pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)委托苏州强耀生物科技有限公司合成。DMEM培养基以及新生牛血清购自GIBCO公司。总RNA提取试剂盒购自Promega公司。反转录试剂盒、PCR相关试剂均购自TaKaRa公司。GnRHR引物(F:5’-GCTCTCTGCGACCTTTA-3’;R:5’-TGTT CCACATCCCATCC-3’)及内参基因β2-M引物(F:5’-GGGTTTCATCCATCCG ACATT-3’;R:5’-CACGGCAGGCATACTCATCTT-3’)委托长春库美生物科技有限公司合成。CCK-8试剂盒购自DOJINDO公司。RIPA裂解液(强)、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。鼠抗人单克隆抗体(ab22168)购自abcam公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

CO2培养箱购自德国Heraeus公司。PCR仪购自Bioer公司。核酸定量分析仪购自Thermo Fisher公司。凝胶图像分析仪购自上海天能公司。多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司。高速低温离心机购自 Hettich公司。电泳槽、电泳仪电源、半干转印仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株使用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，培养于37℃、饱和湿度、含5% CO2的培养箱中。

1.2.2 RT-PCR方法检测CAL-27细胞株中GnRHR的mRNA 根据NCBI数据库GnRHR及β2-M基因序列使用Primer5.0软件设计引物。取生长至80%汇合时的对数生长期细胞，收集细胞提取细胞总RNA，核酸定量分析仪分析并定量显示A260/A280值为1.9，浓度为253 ng/μl。使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit进行反转录合成cDNA。先去除基因组DNA，反应体系为5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、RNA 4 μl 、RNase Free dH2O 3 μl，共10μl 体系42℃加热2分钟后，与PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl、RT Primer Mix 1 μl、5×PrimeScript Buffer 2 4 μl、RNase Free dH2O 4 μl，组成20 μl 体系。37℃ 15 min、85℃5 s，4℃保存。取5 μl cDNA模板与1×Ex Taq buffer(含Mg2+)2 μl、Ex Taq 0.2 μl、上下游引物(10 μM)各0.5 μl、dNTP 1 μl、H2O 10.8 μl构成20 μl扩增体系。反应条件为94℃预变性5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，40个循环，72℃5 min。扩增产物进行1.6%琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后委托长春库美生物科技有限公司进行PCR产物测序。

1.2.3 Western Blot检测CAL-27细胞GnRHR蛋白表达 取生长至80%汇合时的对数生长期细胞，吸去细胞瓶内旧培养基后使用无菌冰PBS清洗两次。细胞刮刀收集细胞至2 ml EP管内2000 rpm离心5分钟，弃上清。再用冷PBS清洗细胞2次，每次洗后离心。300 μl RIPA裂解液与3 μl PMSF(100 mM)混匀后加入至EP管，冰上裂解30分钟后12 000 rpm离心10 分钟，收集上清至新的预冷离心管。取适量蛋白溶液利用BCA法进行浓度测定。

取40 μg蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，然后将蛋白半干转移至NC膜上。含5%脱脂奶粉的TBST溶液37℃温箱中封闭150分钟。TBST洗膜3次每次5分钟后，加入TBST稀释(1∶1000)的鼠抗GnRHR单克隆抗体4℃孵育过夜。洗膜后，HRP标记山羊抗鼠IgG(1∶2000稀释)室温孵育2小时。洗膜后进行DAB显色。

1.2.4 利用CCK-8进行细胞增殖分析 取生长至80%汇合时的对数生长期细胞，无菌PBS清洗两遍，加入0.1%胰蛋白酶1.5 ml，37℃孵育4分钟后去除胰蛋白酶。加入DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，细胞计数板计数后调整细胞浓度至1×105个/ml，将细胞种植在96孔板中，每孔100 μl即10 000 个细胞。96孔板贴壁培养6小时后去除原培养基并加入用DMEM完全培养基稀释的不同浓度的Triptorelin(10、20、40、80μg/ml)以及不含药物的溶剂对照组培养48小时，每个浓度5个复孔。48小时后去除旧培养基，统一更换新培养基，并设置不含细胞的培养基空白对照组，每孔加入10 μl CCK-8溶液37℃培养90分钟后，利用酶标仪检测OD450，记录检测结果。实验重复三次。

1.2.5 数据处理 每个浓度5个复孔的OD450数值去掉一个最大值、一个最小值后取平均值，根据公式：细胞存活率=[(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)]×100%计算细胞存活率，应用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，数据以x—±s表示。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果

以CAL-27细胞cDNA为模板，扩增GnRHR基因序列，对CAL-27细胞的GnRHR基因表达进行初步检测。琼脂糖凝胶电泳图显示GnRHR (167 bp)和内参β2-M(160 bp)基因PCR扩增结果无杂带，经胶回收后进行测序，测序结果序列正确，证实CAL-27细胞存在GnRHR mRNA表达。见图1。

M;TaKaRa DL2000 Marker;1:阴性对照 2:β2-M(160 bp);3:GnRHR(167 bp).

图1 CAL-27细胞GnRHR与内参基因PCR电泳图

2.2 Western Blot检测结果

结果显示在60kDa处出现特异性反应条带，与其他文献所报道的GnRHR蛋白大小一致，表明舌癌CAL-27细胞株存在GnRHR。见图2。

M:Protein Marker;1:CAL-27细胞蛋白

2.3 细胞增殖-毒性检测结果

实验中使用不同浓度的曲普瑞林(10、20、40、80μg/ml)处理CAL-27细胞48小时后使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率来观察曲普瑞林对CAL-27细胞的增殖抑制作用，结果显示随曲普瑞林浓度增加，细胞存活率显著降低 (F=11.535，P<0.001)，分别为(96.92±2.15)%、(93.03±2.35)%、(91.77±2.76)%、(88.62±2.39)%。10 μg/ml组与对照组相比较存活率差异无显著性(P=0.128)，20、40、80 μg/ml组与对照组比较差异均具有极显著性(P<0.01)。见图3。

图3 曲普瑞林处理CAL-27细胞48小时后的存活率

3 讨论

近二三十年，得益于癌症基因组学的发展，使癌症靶向性治疗成为可能。例如伊马替尼可以特异性作用于BCR-ABL酪氨酸激酶，使其对慢性粒细胞白血病有较好的疗效[14]。再如曲妥珠单抗特异性作用于HER2高表达的乳腺癌细胞，阻断HER2相关信号通路，使其成为目前HER2阳性乳腺癌患者主要靶向治疗药物[15]。GnRH激动剂亦是一种靶向性药物，目前已有曲普瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林应用于临床治疗前列腺癌、乳腺癌、子宫肌瘤、子宫内膜异位以及多种性激素相关疾病。曲普瑞林的氨基酸序列与I型促性腺激素释放激素相比较，其第六位由色氨酸代替了天然序列中的甘氨酸。在人体内，由于血清蛋白酶的裂解作用，GnRH-I的半衰期只有2-5分钟，而包括曲普瑞林在内的一系列的GnRH激动剂都延长了半衰期并提高了与受体的结合力[16]。在对于前列腺癌的治疗中，曲普瑞林是一线激素治疗药物，在临床应用中，对于晚期前列腺癌患者具有较好的疗效和安全性[17]。本研究结果显示人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞表面存在GnRHR，在人口腔癌细胞或组织中发现GnRHR的存在在国内外尚属首次。研究显示，GnRHR在肿瘤组织中表达量很少[18]，本研究发现曲普瑞林对CAL-27细胞的抑制作用呈剂量依赖性关系，这可能与GnRH与其受体的高亲和力有关。在垂体外肿瘤组织中，GnRH及其受体构成了自分泌、负调控系统，使得其具有抗癌活性[19]。这一发现使得学者们对GnRH所介导的细胞内信号转导通路产生浓厚兴趣。Patrizia Limonta等人的研究发现，与垂体内GnRH的信号通路不同，GnRH-I激动剂不会影响PLC介导的磷脂酰肌醇代谢或细胞内Ca2+水平。GnRH及其类似物与受体结合后，激活酪氨酸磷酸酶使癌细胞表皮生长因子受体去磷酸化[20]。目前我们尚不清楚GnRH及其类似物对口腔癌的抑制作用是否与此相关，未来我们将对此问题进行深入探讨。本研究对解释体内激素水平影响肿瘤组织的生长状态有重要意义，这将有助于提升口腔癌的预后维护以及临床新药开发。

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The expression of GnRHR on CAL-27 cells and the inhibitory effect of Triptorelin on the proliferation of CAL-27 cells in vitro

LIJian,WEIHong-tao,ZHANGGuo-li,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the antiproliferation effect of GnRH-I analogue Triptorelin on human tongue squamous cell carcinoma cell line CAL-27 in vitro.Methods RT-PCR method was used for detection of gonadotropin releasing hormone receptor (GnRHR) mRNA in CAL-27 cell line.Western blot was employed to detect the expression of GnRH receptor on CAL-27 cells.CAL-27 cells were treated with different concentrations of Triptorelin for 48 hours and then OD450 was detected using CCK-8 assay to calculate the cell viability.Results The result of RT-PCR showed that CAL-27 cells have GnRHR mRNA.Western Blotting has showed that the protein samples of CAL-27 cells have specific reaction at approximately 60 kDa.CCK-8 detection showed a significant decrease in cell viability rate with the increase of concentration of Triptorelin (P<0.01).Conclusion CAL-27 cell line has the gene and protein expression of GnRH receptor .Our results demonstrate that Triptorelin has inhibitory effect on CAL-27 cells.

Triptorelin;Gonadotropin-releasing hormone receptor;Tongue cancer

吉林省自然科学基金(20160101095JC)

1007-4287(2017)03-0475-04

R739.86

A

2016-07-06)

*通讯作者