陈 健，孙志强，李玉权，武广恒

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

*通讯作者

IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性与宫颈癌的关系

陈 健1，孙志强1，李玉权1，武广恒2*

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的重要危险因素[1]，但仅有一定数量的HPV 感染者最终罹患宫颈癌，说明遗传易感性在个体之间存在着差异，其作用可能在特定条件下被激发，并在肿瘤发生中起到重要作用。干扰素(IFN)是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的十分重要的细胞因子,具有拮抗肿瘤、广谱抗病毒以及免疫调节等广泛的生物活性。研究显示[2]，在IFN-γ基因中存在6个多态性位点，其中第一内含子+874位点A/T单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，可以通过改变转录因子的结合位点的方式进而影响到相关基因的表达数量[3]。本实验中运用单核苷酸多态性基因分型方法,比较宫颈癌病例组和对照组IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性基因型频数和等位基因频数差异,进而探讨IFN-γ基因与宫颈癌发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 检测对象 实验组：69例，汉族，其中鳞癌62例、腺癌7例,上述病例为吉林省肿瘤医院住院病人，就诊时间为2013年6月-2015年8月。经病理切片确切诊断为宫颈癌，同时排除其他类型癌症，年龄44.6±10.7岁；对照组：69例，汉族，为同一医院同时期体检正常的女性，无既往肿瘤病史，年龄45.2±9.4岁。

1.2 样本的收集和处理 用真空采血管(5 ml，含有抗凝剂肝素钠)收集静脉血，采用TE饱和重蒸酚、氯仿/异戊醇混合液抽提法提取检测对象外周血基因组DNA，-20℃保存。

1.3 引物 GenBank 检索IFN-γ序列(NC-000012)，Primer 5.0设计引物，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。F1(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatca-3′，F2(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatct-3′，R(下游通用引物)：5′-gctacatctgaatgacctgc-3′，PCR扩增，片段长度527 bp。

1.4 检测基因型 采用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR 总的反应体系为50 μl，PCR反应条件：94℃ 1 min 、58℃ 50 s、72℃ 45 s，31个循环，72℃延伸10 min。PCR产物8 μl，1.0%琼脂糖凝胶电泳电压95V，35 min，凝胶成像系统分析并保存图像。

1.5 统计分析 首先检验基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律的要求，基因型和等位基因频数的分布差异采用χ2检验方法，采用SPSS13.5 统计分析软件进行数据处理及统计分析。用比值比(OR)和95%参数置信区间来评估相对风险程度。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 定律检验χ2检验结果表明，实验组、对照组基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律要求(P>0.05)。

2.2 基因型、等位基因分布状况 IFN-γ基因通过PCR扩增后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，根据单核苷酸多态性可分为AA、AT和TT等三种基因型，详见表1和图1。同一样本用F1、R引物及F2、R两对引物分别扩增，如结果均出现527 bp长度片段，称为AT基因型，如只有其中一对引物可以扩增出527 bp长度片段，称为AA或者TT基因型。经检验，AA、AT和TT三种基因型实验组中的频数分布与对照组比较具有显著性差异(χ2=4.830，P=0.028)；AA基因型频数分布与对照组相比较差异具有显著性(χ2=4.182，P=0.042)；实验组和对照组的基因型频数的相对危险度分析后发现，AA / TT：OR=2.02，95%CI:1.03-3.97，AA基因型患卵巢癌的风险是TT基因型的2.02倍；实验组和对照组中A与T两个等位基因之间频数分布比较具有显著性差异(χ2=6.059，P=0.014)，相对危险度分析结果，A / T ：OR=1.91，95%CI:1.14-3.20,A等位基因患卵巢癌的风险度是T等位基因的1.91倍。

2.3 病例组中鳞癌与腺癌之间，基因型频数和等位基因频数相比较，差异均无显著性，见表2。

M:Marker(DL-2000);1-2:AA基因型;3-4:AT基因型;5-6:TT基因型;PCR 产物长度均为527 bp

图1 PCR产物电泳后AA、AT和TT三种基因型的电泳图谱

表1 宫颈癌病例组、正常对照组基因型频数和等位基因频数分布状况

表2 宫颈癌实验组病理类型中基因型频数分布状况

3 讨论

目前，细胞因子与宫颈癌遗传易感性关系的研究不断取得进展，研究提示[4]，IL-12A rs568408 和IL-12B rs3212227 多态性可能单独或联合作用影响江苏地区女性的宫颈癌发病风险；Tamandani 等[5]研究揭示，HPV18 或 HPV18 合并16型感染患者中 IL-1RA AB 基因型患宫颈鳞癌和腺癌风险降低。IFN-γ的合成量受基因调控，存在着较大的个体差异，究其原因可能是基因调节区的多态性，或者说等位基因的多态性直接控制着IFN-γ的合成[6]。IFN-γ基因+ 874位点存在于IFN-γ基因第一个内含子区域，包括 AA、AT、TT 3种基因型，转录因子NF-kappaB的结合位点刚好与+ 874 位点处于同一位置，此位置出现的SNP可直接影响到与转录因子的结合能力，从而影响IFN-γ的转录[7]。据报道，IFN-γ基因第一内含子+874位点多态性与肿瘤在内的一些疾病具有相关性[8]。Kordi Tamandani等[9]经过研究发现，IFN-γ基因+874位点的AT和AA+AT基因型在印度北部人群中与宫颈癌发生风险升高有关，带有等位基因A的个体产生IFN-γ的能力较低，提示+874位点单核苷酸多态性在决定个体HPV遗传易感性方面可能承担着十分重要的作用。

本文结果显示，AA基因型、A等位基因可能是该群体宫颈癌发生的危险因素。除此之外，该群体宫颈鳞癌和腺癌之间基因型频率以及等位基因频率相比较，均未见显著性差异，表明本群体该位点SNP在宫颈癌病程中不存在组织学类型的特异性。

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[4]陈小军,钱年凤,胡志斌等.IL-12A和IL-12B基因多态性与江苏人群宫颈癌遗传易感性相关[J].南京医科大学学报,2009,29(8):1148.

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[6]BEN-ARI Z,MOR E,PAPO O,et al.Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatit is B virus[J].Am J Gustroenterol,2003,98:144.

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[9]Kordi Tamandani MK,Sobti RC,Shekari M,et al.Expression and polmiorphism of IFN-gamma gene in patients with cervical cancer [J].Exp Oncol,2008,30(3):224.

1007-4287(2017)03-0498-02

2016-05-17)