王炬玮，臧文远,刁 凯,刘海燕

(吉林油田总医院 1.血液肿瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

杠柳毒苷体外抑制胃癌细胞增殖能力的分子共调控网络构建研究

王炬玮1，臧文远2,刁 凯1,刘海燕1

(吉林油田总医院 1.血液肿瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

目的 探讨构建杠柳毒苷体外抑制胃癌细胞系SGC-7901细胞增殖能力的分子共调控网络，为解析杠柳毒苷抗肿瘤作用的分子机制提供理论支撑。方法 本研究收集美国GEO公开数据库中已收录的所有杠柳毒苷处理胃癌SGC-7901细胞系前后的基因表达谱数据；通过差异表达分析获得经过杠柳毒苷处理后胃癌SGC-7901细胞系表达水平发生显著性改变的基因；通过GO基因功能注释以及KEGG代谢通路富集分析，探究杠柳毒苷作用后表达水平发生显著性改变基因的功能；最后结合TRED数据库中收录的人类转录因子信息，构建分子共调控网络。结果 与胃癌SGC-7901细胞系相比，经杠柳毒苷处理后的SGC-7901，其癌细胞中共有1105个基因发生差异表达，其中552个基因上调表达，553个基因下调表达。基因功能分析显示，表达上调基因主要参与葡萄糖代谢、钾离子转运、钠离子转运等生物功能；表达下调基因主要参与同嗜性细胞粘着、氨基酸转运、小GTP酶介导的信号转导等生物功能。KEGG代谢通路富集分析结果显示，差异表达基因主要参与肿瘤相关的诸多代谢通路。最后，基于差异表达基因及TRED数据库中所收录的人类转录因子信息，对差异表达基因进行分子偶联，构建了分子共调控网络。结论 基于分子共表达网络，对杠柳毒苷的作用分子机制进行了系统性挖掘。

杠柳毒苷；胃癌SGC-7901细胞系；分子共调控网络；细胞增殖

(ChinJLabDiagn,2017,21:0392)

中药香加皮(cortex periplocae)是萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca L.)植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)干燥处理后的根皮。味辛、苦，性温，有毒性，可用于风寒湿痹、腰膝酸软、心悸气短、下肢水肿等症[1]。近年来研究发现，香加皮正丁醇提取物杠柳毒苷(periplocin)对包括食道癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等在内的多种实体瘤细胞具有较强的肿瘤增殖抑制作用[2-6]。但具体作用的分子机制仍不完善，为进一步探究杠柳毒苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用机理，本研究将利用高通量基因芯片技术，挖掘杠柳毒苷体外抑制胃癌细胞增殖能力的分子调控模式，为进一步开发基于杠柳毒苷的抗肿瘤药物研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据来源

收集美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)维护的GEO数据库中所有经杠柳毒苷处理的胃癌基因芯片数据，收集数据时间截至2016年5月3日。

1.2 数据库资源

使用基因本体论数据库(Gene Ontology，GO)对所分析得到的差异表达基因进行功能注释；使用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库对差异表达基因进行代谢通路富集分析；使用转录作用元件数据库(Transcriptional Regulatory Element Database，TRED)对差异表达基因进行转录因子筛选。

1.3 方法

1.3.1 差异表达基因筛选及注释 为探究杠柳毒苷对胃癌细胞增殖能力影响的分子机制，使用R语言下载了GEO数据库中GSE78211数据集的原始数据。使用MAS 5.0算法对数据集中的原始数据进行标准化预处理。使用Limma程序包中所提供的统计分析函数，计算了与胃癌SGC-7901细胞系相比，经杠柳毒苷处理后SGC-7901胃癌细胞中表达水平发生变化的基因。选取差异表达倍数≥5.0(Fold Charge≥5.0)为筛选阈值，筛选获得差异表达基因。利用R语言，将筛选得到的差异表达基因与GEO数据库提供的GPL平台注释信息进行匹配，对差异表达基因进行信息注释。

1.3.2 差异表达基因GO功能注释分析 为探究差异表达基因所参与的生物功能，对筛选得到的差异表达基因进行GO功能注释分析。提取差异表达基因GPL平台注释信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，使用R语言GO程序包与GO数据库信息，对每一个差异表达基因进行功能注释，探究SGC-7901细胞中每一个经杠柳毒苷作用而发生表达水平改变的基因功能，初步推测杠柳毒苷抗肿瘤作用的分子机制。

1.3.3 差异表达基因KEGG代谢通路富集分析 为进一步探究差异表达基因参与生物代谢的代谢通路，对筛选得到的差异表达基因进行KEGG代谢通路富集分析。提取差异表达基因GPL平台注释信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，应用R语言KEGG程序包与KEGG数据库信息，对每一个差异表达基因向已知的代谢通路进行富集映射，探究差异表达基因集中映射的细胞代谢通路，初步推测杠柳毒苷所影响的主要代谢通路。

1.3.4 分子共调控网络构建 为进一步挖掘杠柳毒苷体外抑制胃癌细胞增殖能力的分子调控模式，探究差异表达基因之间的相互调控作用关系，提取TRED数据库中所收录的所有人类转录因子数据。通过Pearson相关性分析，提取基因间分子共调控作用关系。使用Cytoscape version 3.3.0软件对得到的分子共调控作用关系进行可视化展示，构建出最终的分子共调控网络。

2 结果

本研究共筛选得到差异表达基因1105个，其中552个基因上调表达，553个基因下调表达，表1、2分别展示差异表达最显著的20个基因。

表1 Top 20上调表达基因信息

表2 Top 20 下调表达基因信息

对552个上调表达基因与553个下调表达基因分别进行GO功能注释分析。注释分析结果显示，上调表达基因主要参与葡萄糖代谢、钾离子转运、钠离子转运等生物过程(图1.A)，参与构成钠离子通道复合体、复制叉、膜筏、生物质膜等细胞组件(图1.C)，以及参与钠离子协同转运载体活性、钾离子泵活性、DNA结合等分子功能(图1.E)；下调表达基因主要参与同嗜性细胞粘着、氨基酸转运、小GTP酶介导的信号转导等生物过程(图1.B)，参与联会丝复合体、分泌颗粒体、细胞链接等细胞组件(图1.D)，参与葡萄糖转膜转运复合体活性、小GTP酶调节因子活性等等分子功能(图1.F)。而对差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析结果显示，差异表达基因主要参与肿瘤相关的诸多代谢通路(图2)。

基于分子间共调控关系，最终构建了杠柳毒苷作用后SGC-7901胃癌细胞中发生表达改变的分子共调控网络关系(图 3)。结果显示，杠柳毒苷可能通过抑制MYC转录因子等经典肿瘤增殖促进因子的表达，间接调控下游众多基因的表达，最终抑制肿瘤细胞的增殖。

图1 差异表达基因GO功能注释分析 A上调表达基因GO功能注释生物过程(BP)条目；B下调表达基因GO功能注释生物过程(BP)条目；C上调表达基因GO功能注释细胞组分 (CC)条目；D下调表达基因GO功能注释功能注释细胞组分 (CC)条目；E上调表达基因GO功能注释分子功能 (MF)条目；F下调表达基因GO功能注释功能注释分子功能(MF)条目。

图2 差异表达基因KEGG代谢通路富集分析 A上调表达基因KEGG富集分析结果；B下调表达基因KEGG富集分析结果。

图3 杠柳毒苷抑制胃癌SGC-7901增殖的分子共调控网络 其中红色圆代表上调表达基因；蓝色圆代表下调表达基因；黄色菱形代表转录因子。

3 讨论

目前已有研究显示，来源于香加皮的提取物杠柳毒苷在体外对多种实体瘤细胞具有显著的细胞毒性，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖。研究证实，杠柳毒苷能够诱导肺癌A549细胞系细胞、胃癌细胞系BGC-823细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞系细胞的凋亡进程[7-9]。与此同时，杠柳毒苷能够通过阻滞细胞周期进程，显著地抑制包括肝癌、结肠癌、乳腺癌等实体瘤细胞系的增殖，而杠柳毒苷的作用效果与其使用量呈正相关[10，11]。

肿瘤是一种复杂的系统性疾病，其发生发展是一系列具有相互作用关系关键基因的表达异常所导致的[12，13]，所以药物对肿瘤细胞的抑制作用同样是通过复杂的作用方式达到抗肿瘤的效果。然而，传统针对于单一分子表达异常的“还原论”研究模式，无法从整体系统层面上探究分子间的作用关系，无法具体地勾勒药物作用的复杂分子机制。同时鉴于杠柳毒苷如何作用于肿瘤细胞，最终导致抗肿瘤效果的分子作用机制尚不明确，本研究利用高通量基因芯片技术，通过生物信息学手段，系统性地预测并构建了一张杠柳毒苷作用于胃癌细胞系SGC-7901的分子共调控网络。该分子共调控网络从整体角度分析了经杠柳毒苷处理后SGC-7901细胞系表达发生改变基因间相互作用关系，展示了杠柳毒苷通过调节包括MYC、MYB、SP2在内的关键肿瘤增殖相关转录因子的表达，间接调控众多下游基因表达水平的整体基因共调控模式，揭示杠柳毒苷潜在的抗肿瘤作用分子机制。为以杠柳毒苷为基础的抗肿瘤药物研发奠定了坚实的理论基础，同时为抗肿瘤药物作用机理领域的研究提供了新的研究思路。

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Construction of Gene-Coregulation-Network for Inhibition Activities of Periplocin on gastric cancerexvivo

WANGJu-wei,ZANGWen-yuan,DIAOKai,etal.

(TheGeneralHospitalofJinlinOilField,Songyuan138000,China)

Objective In this study,we constructed a Gene-Coregulation-Network to demonstrate the molecular mechanism of how periplocin inhibits the proliferation of gastric cell line SGC-7901.This study may lay a foundation for underlining the molecular mechanism of the anti-tumor activity of periplocin.Methods By collecting SGC-7901 gene expression profiling data from GEO database,we analyzed the differentially expressed genes.Utilizing GO and KEGG database,we annotated all of the differentially expressed genes.Finally,using transcription factor data provided by TRED database andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene coregulation network.Results Compared with normal SGC-7901 cell lines,1105 genes were differentially expressed in the SGC-7901 cells treated with periplocin,among which 552 genes were up regulated and 553 genes were down regulated.GO annotation results showed that up regulated genes mainly took part in biological functions including glucose metabolism,potassium ion transport and sodium ion transport,and down regulated genes mainly took park in biological functions including hemophilic cell adhesion,amino acid transport,small GTPase mediated signal transduction.KEGG pathway enrichment analysis results showed that,the differentially expressed genes mainly join many cancer-related metabolism pathways.Finally,based on the transcription factor data andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene co-regulation network.Conclusion Based on molecular co-regulation analysis,we systemically mining the molecular mechanism of periplocin.

Periplocin;Gastric cancer SGC-7901 cell line;Gene-coregulation-network;Cell proliferation

1007-4287(2017)03-0392-04

R735.2

A

王炬玮(1980-)，女，吉林省松原市，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤的诊断与治疗。

2016-09-11)