隋兆峰 ， 迟灵芝 ， 杨明彩 ， 徐建义

(山东畜牧兽医职业学院 ， 山东潍坊261061)

肉种鸡场孵化后期死胚禽支原体感染率调查

隋兆峰 ， 迟灵芝 ， 杨明彩 ， 徐建义

(山东畜牧兽医职业学院 ， 山东潍坊261061)

对疑似鸡毒支原体感染的某肉种鸡场送检的100枚孵化后期死胚和10只发病典型的弱雏进行了禽支原体分离鉴定和PCR检测。同时，从孵化率正常的种鸡场采集100枚孵化后期死胚作为对照。通过分离鉴定，发病养殖场死胚中分离到3株鸡毒支原体(MG)，弱雏中分离到2株MG。对临床分离株进行16S rDNA基因的测定与分析，5株分离株16S rDNA基因同源性为100%，在所建系统发育树中与MG S6株(GenBank登录号：CP006916.2)处于同一分枝。PCR检测结果显示，发病养殖场死胚和弱雏的阳性率分别为57%和100%，对照养殖场死胚MG的阳性率为4%。

禽支原体 ； 死胚 ； 感染率

禽支原体病几乎在世界各地都有发生，严重影响着养鸡业的健康发展，给养禽业造成重大经济损失。我国鸡的MG感染阳性率为50%～80%[1]。在产蛋母鸡，MG的暴发除造成死亡率上升外，还可造成产蛋量下降5%～10%，并可通过种蛋传播给下一代，雏鸡的弱雏率增加10%左右。

2016年上半年，山东某肉种鸡场出现孵化率降低、孵化后期胚胎死亡明显增多、弱雏量增加等疑似禽支原体感染的现象，对该发病养殖场送检的100枚孵化后期死胚和10只发病典型的弱雏进行禽支原体分离鉴定和PCR检测，以确定其死胚禽支原体感染率。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

1.1.1 样品信息 2016年2月份以来，山东某一大型AA父母代肉种鸡场，在大约44周龄时出现孵化率降低，孵化后期胚胎死亡尤其是能啄壳不能出壳的死胚明显增多，约占17%～20%；弱雏量增加，约占7%～10%；病理剖检可见部分死胚气囊浑浊增厚，少数死胚肺支气管中有干酪样栓塞；部分孵出的雏鸡于3日龄左右即开始出现张口喘、甩鼻等呼吸道症状，病理剖检可见气囊炎。截止到46周龄时，该情况无明显改善，随机采集100枚能啄壳不能出壳的死胚及10只3日龄左右出现呼吸道症状的弱雏送本实验室进行禽支原体检测。同时，从某孵化率正常的种鸡场采集100枚孵化后期死胚进行禽支原体检测，作为对照。

1.1.2 样品处理 无菌操作采集2～4 g死胚的卵黄囊(附带少量卵黄)及弱雏肺、气囊充分剪碎后加入3 mL PBS中，于4 ℃浸泡12～24 h。

1.2 主要试剂 改良Frey氏液体、固体培养基，参照现行《中国兽药典》(三部)上规定方法配制；醋酸铊，购自美国Sigma公司；水解乳蛋白，购自英国Oxoid公司；琼脂粉，购自美国Difco公司；2×TaqMaster Mix，购自Biomiga公司；动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；鸡毒支原体S6株及抗血清，购自中国兽医药品监察所。

1.3 禽支原体分离鉴定

1.3.1 分离培养 取1 mL浸泡液用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液按 1∶10 加入支原体液体培养基中，放入 37 ℃温箱振荡培养；同时取0.2 mL滤液接种于支原体固体培养基中，放入 37 ℃、5%CO2培养箱培养。每天检查液体培养基颜色变化，一旦发现培养基颜色变成橘黄色，立即移植于固体培养基上培养。固体培养基中培养5～7 d后，在10倍倒置显微镜下观察有无菌落及菌落形态。对于液体培养物在14 d内未发生颜色变化，固体培养基上 14 d 内无典型菌落生长的，则认为分离结果为阴性。

1.3.2 生长抑制试验 取直径6 mm灭菌滤纸片加0.02 mL MG S6抗血清浸透，待干燥后，于-20 ℃保存备用。将初步判定有支原体生长的液体培养物移植到支原体固体培养基上，待菌落长成后，挑选单个菌落接种支原体液体培养基获得纯培养物。取适量纯化的液体培养物稀释至104、105CCU/mL后，分别取0.2 mL涂布于支原体固体培养基表面，将已制备的MG S6抗血清滤纸片均匀贴于培养基表面。放入 37 ℃、5%CO2培养箱培养。待菌落出现后，低倍镜下量出抑制带宽度即从纸片边缘到菌落边缘的距离。同时以MG S6株作为阳性对照。

1.3.3 16S rDNA鉴定及系统发育树构建 采用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取参考株MG S6和临床分离株模板DNA。选用16S rDNA通用引物(见表1)进行PCR扩增。PCR产物经胶回收纯化后，送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI 网站进行核酸相似性检索并利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

1.4 禽支原体特异性基因扩增

1.4.1 模板DNA提取 取1.5 mL组织浸泡液匀浆后，12 000 r/min离心20min, 弃上清液。沉淀组织采用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取。

1.4.2 引物选择与合成 根据MG Mgc2基因和MS 16S rDNA基因的保守区域，合成2对引物：Mgc2和MS16s(见表1)。

表1 引物信息

1.4.3 PCR扩增 分别采用引物Mgc2和MS16s对提取的模板进行PCR扩增。反应体系的总体积为20 μL，其中2×Taq Master Mix为10 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL，模板1 μL。反应程序为：94 ℃预变性 90 s；94 ℃ 变性30 s，引物退火温度(见表1) 30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃终止反应。反应结束后，取5 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4.4 PCR产物测序及分析 随机挑选发病养殖场所采集样品的5个PCR产物经胶回收纯化后，送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI 网站进行核酸相似性检索。

2 结果

2.1 禽支原体分离鉴定

2.1.1 分离培养 从100枚死胚中共分离出3株疑似菌株，从10只弱雏中分离出2株疑似菌株。初次培养在液体培养基中需7～10 d变色，呈清亮黄色，轻轻振荡，有丝状或絮状物悬浮；固体培养物置于10×倒置显微镜下观察，呈典型的中央突起“乳头状”菌落(见图1)。

2.1.2 生长抑制试验 将贴有MG S6抗血清的固体培养物于 37 ℃、5%CO2条件培养7 d后，10×倒置显微镜下观察，培养基表面有密集的“乳头状”菌落存在，但抗血清滤纸片周围2 mm内无支原体菌落出现，表明临床分离株为MG。

图1 MG在固体培养基上的菌落形态(10×)

2.1.3 16S rDNA鉴定及系统发育树构建 对分离得到的5株菌株选用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，结果扩增出长约1.5 kb的目的片段。将测序结果于NCBI网站进行核酸相似性检索，5株分离株的核苷酸序列同源性为100%，与NCBI登录的MG同源性在99%以上，最终判定该5株分离株为MG。系统发育树显示(见图2)，临床分离株与MG S6(GenBank登录号：CP006916.2)亲缘关系最近。

2.2 禽支原体特异性基因扩增 PCR扩增结果显示，使用引物对Mgc2进行扩增，发病种鸡场100枚鸡胚中有57个样品扩增出相应的条带(见图3)，阳性率为57%；10只弱雏样品均扩增出相应条带，阳性率为100%；孵化率正常的种鸡场100枚鸡胚中仅有4个样品扩增出相应条带，阳性率4%。挑选发病种鸡场5个PCR产物进行序列分析，5个样品的Mgc2基因同源性为100%，与MG S6(GenBank登录号：CP006916.3)同源性为97%。使用引物对MS16s进行扩增，所有样品扩增结果均为阴性。

图3 部分样品检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker； +：阳性对照； —：阴性对照； 1～18：部分样品检测结果

3 讨论

禽支原体在在死胚的卵黄、卵黄囊和绒毛尿囊中含量最高[2]。因此，本文选择死胚的卵黄囊(附带少量卵黄)作为研究对象。但死亡的鸡胚中常混有其他细菌感染，如葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、变形杆菌等，这些细菌常在培养24 h内使支原体液体培养基变浑浊、变色，从而抑制或掩盖了禽支原体的生长，造成支原体临床分离困难。而培养基中添加的青霉素主要对革兰阳性菌有效，而对革兰阴性菌作用不大。根据禽支原体大小0.2～0.5 μm，多数可通过0.45 μm的细菌滤器这一特性，我们将样品充分剪碎后，经4 ℃浸泡12～24 h，取上清用孔径0.45 μm的微孔滤膜过滤，可剔除大多数杂菌的影响。

在种鸡各种防控支原体措施中，免疫尤其活疫苗免疫依然是综合控制的核心和重点。国内用于预防禽支原体的疫苗主要是F株、TS-11株和6/85株。TS-11和6/85对未受MG感染的鸡有较好的免疫效果，但免疫鸡体内检测不到或低循环的抗体，不易判断免疫效果。Yoder证实[3]，有些鸡的抗体水平处于中等或较低状态时，仍对MG强毒株有较强的抵抗力。因此，通过血清学方法无法判断养殖场MG的免疫效果。禽支原体可垂直传播，引起种蛋孵化率降低及孵化后期胚胎死亡。有研究报道[4]，未免疫种鸡群在感染后3～6周，有50%以上的鸡蛋被感染。因此，通过对孵化后期死胚禽支原体感染情况调查可判断种鸡场禽支原体防控效果。本研究选择分离培养和PCR两种方法进行禽支原体感染率调查。

对死胚进行分离培养，仅分离得到了3株MG，分离率低。支原体分离率低，可能与支原体初次分离生长条件苛刻，样品中组织抗原、抗体、毒素等因素抑制支原体生长，支原体数量少或支原体已经死亡，及样品过滤降低了样品中支原体的数量有关。因此，支原体分离培养难以用于评价死胚中禽支原体的感染情况，但对禽支原体致病性研究、敏感药物筛选等方面仍是必须的。

[5-6]，确定Mgc2为MG临床病料首选的PCR检测方法。PCR法检测MG特异性DNA与需要用几天时间才能在培养物中分离出MG相比，不但可以在几小时内就判定出阴性或阳性结果，而且不需要样品中必须含有活着的MG，也不易受到其他微生物污染的影响。因此，PCR法调查禽支原体感染情况明显优于分离培养法。PCR法检测结果显示，发病种鸡场死胚MG的阳性率为57%，10只弱雏的阳性率为100%，而对照养殖场死胚阳性率仅为4%，结合该种鸡场死胚增多、弱雏量增加等现象，最终判定该种鸡场感染了MG。

对5株临床分离株进行16S rDNA鉴定及系统发育树构建发现，5株分离株的核苷酸序列同源性为100%，证明该养殖场发生的MG感染为同一菌株，分离株与MG S6(登录号：CP006916.2)亲缘关系最近，与国内常用的疫苗株F相对较远，证明临床分离株为野毒株。禽支原体特异性基因Mgc2扩增，5个样品的Mgc2基因同源性为100%，与MG S6(GenBank登录号：CP006916.3)同源性为97%，也可证实该养殖场发生的MG感染为同一菌株。

参考文献：

[1] 宁宜宝. 动物支原体病预防与控制的研究进展[J]. 中国兽药杂志, 1999，33(1):45-48.

[2] 塞弗Y M．禽病学[M]．苏敬良，高福，索勋，译．12版.北京：中国农业出版社，2012：958-959.

[3] Yoder H.W,Jr,Hopkins S R,etal. Evaluation of inacticated Mycoplasma gallisepticum oil-emulsion bacterins for protection against arisacculitis in broilers[J]. Avian Dis,1984,28:224-234.

[4] Sasipreeyajan J,Halvorson D A,Newman J A. Effect of Mycoplasma gallisepticum bacterin on egg-transmission and egg production.[J]. Avian Diseases,1987,31(4):776-781.

[5] García M,Ikuta N,Levisohn S,etal. Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens.[J]. Avian Diseases,2005,49(1):125-132.

[6] 赵杰,徐建义,隋兆峰,等. 鸡毒支原体套式PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学,2015，45(7):706-710.

Infection rate investigationofAvianMycoplasmsof late hatched dead embryo onsome breeding bird Farm

SUI Zhao-feng， CHI Ling-zhi， YANG Ming-cai， XU Jian-yi

(Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College, Weifang 261061, China)

Isolation, identification and PCR detection ofAvianMycoplasmsin 100 pieces of dead embryos and 10 typical cases of weak young were performed. At the same time, 100 dead embryos collected from the late hatching period on a normals hatching rate of chicken farm were collected as controls. Through isolation and identification, 3 strains ofMycoplasmagallisepticum(MG) were isolated from the dead embryos of the diseased farms, and 2 strains of MG were isolated from the weak chicks.16S rDNA determination and analysis in clinical isolates were used for further identification, Our result showed that the homology of 16S rDNA gene of the 5 strains was 100%, and isolates and S6 MG strain (GenBank accession number: CP006916.2) were on the same branch in the phylogenetic tree. NoMycoplasmasynoviae(MS) was isolated.PCR results showed that The positive rate of MG in dead embryos and weak chick from infected birds were 57% and 100%,and the positive rate of MG in dead embryoes from normal hatching rate of a chicken farm were 4%.

Avian Mycoplosms ； dead embryo ; infection rate

2016-07-27

公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303044)；国家星火计划项目(2013GA740076)；潍坊市科学技术发展计划项目(2014GX066)

隋兆峰(1977-)，女，讲师，硕士，主要从事预防兽医学的教学和研究，E-mail：smile_sui@sina.com

S831.7； S851.3； S858.31

A

0529-6005(2017)02-0010-04