陈程，张存劳，罗国平，陈奇

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

HPLC法同时测定制首乌无糖颗粒中大黄素、大黄素甲醚的含量

陈程，张存劳，罗国平，陈奇

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

目的 建立制首乌无糖颗粒中大黄素、大黄素甲醚的含量测定方法。方法采用Agilent 5TC-C18 (150×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸(80:20)，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温25℃。结果大黄素和大黄素甲醚分别在0.08～0.8 μg(r1=0.999 8)、0.04～0.4 μg(r2=0.999 7)范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.04%、99.58%，RSD分别为0.77%，0.71%。3批样品中大黄素的含量分别为0.159 mg/g、0.161 mg/g、0.170 mg/g，大黄素甲醚的含量分别为0.055 mg/g、0.064 mg/g、0.072 mg/g。结论本方法准确、专属性好、重复性好，可作为制首乌无糖颗粒质量控制方法之一。

HPLC；制首乌无糖颗粒；大黄素；大黄素甲醚

制首乌为何首乌(Polygonum muhiflorum Thunb)的炮制加工品，具有补益精血、固肾乌须的功效[1]。现代药理研究表明制首乌中二苯乙烯苷类化合物具有提高免疫力、抗衰老、防治动脉硬化及保肝等作用，临床上主要用于防止高血压病、高血脂病等，效果良好[2]。为了适应糖尿病、高血压等的患者使用特点，前期研制了制首乌无糖颗粒，并结合主要药效成分二苯乙烯苷初步建立了质量标准。但是研究表明制首乌及复方制剂在临床应用中可能导致肝损伤，蒽醌类成分可能是致肝损伤的物质基础，制首乌中蒽醌类主要成分为大黄素及大黄素甲醚[3]。因此为进一步全面评价制首乌无糖颗粒的质量，本文建立制首乌无糖颗粒中大黄素、大黄素甲醚的含量测定方法，为其质量评价提供新的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；SQP型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)。

1.2 材料 制首乌饮片(购于西安中药饮片有限公司，生产批号120208，经薄层鉴别，符合《中国药典》2015版一部规定)；制首乌无糖颗粒(实验室自制，批号分别为20160302、20160303、20160304)；大黄素标准品(上海土蜂生物科技有限公司，批号：15041713)；大黄素甲醚标准品(上海土蜂生物科技有限公司，批号：15031127)；色谱甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 取大黄素、大黄素甲醚适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含大黄素80 μg、大黄素甲醚40 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密称定制首乌无糖速溶颗粒4.0 g，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL并迅速称定，加热回流提取60 min，取出放冷，再次迅速精密称定，用甲醇补足重量，摇匀，用滤纸过滤，取续滤液经0.22 μm微孔滤膜过，即得。

2.1.3 阴性对照溶液 按照处方量和制备工艺制成缺制首乌的样品，并按“2.1.2”项下方法制得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent 5TC-C18 (150×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸(80：20)；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；检测波长为254 nm；进样量为10 μL。

2.3 系统适用性 分别取“2.1”项下3种溶液并按“2.2”项下色谱条件下进样，记录色谱图。结果表明，供试品溶液大黄素、大黄素甲醚与杂质峰之间得到很好地分离，阴性对照对测定无干扰，表明本方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL，分别按“2.2”项下色谱条件进行进样分析。以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线并进行回归计算。回归方程分别为：Y1=2743.6X1+1.0410，r1=0.9998；Y2=1653X2-1.4738，r2=0.999 7。结果表明大黄素、大黄素甲醚分别在0.08～0.8μg、0.04～0.4μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 将对照品溶液重复进样5次，结果大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.58%、1.19%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取制首乌无糖颗粒(20160302)按“2.1.2”和“2.2”项下方法制备供试品6份，分别进样测定。结果大黄素、大黄素甲醚的平均含量分别为0.145 mg/g、0.057 mg/g；峰面积RSD分别为1.58%、1.39%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取制首乌无糖颗粒(20160302)的供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12、24 h进样测定。大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD分别为1.74%、1.50%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称定已知含量的样品(20160302)6份，每份2.0 g，加入对照品溶液适量，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液并按照“2.2”项下色谱条件进样测得含量，进而计算加样回收率，见表1。结果表明大黄素加平均样回收率为100.04%、RSD为0.77%，大黄素甲醚平均加样回收率为99.58%、RSD为0.71%，表明本方法准确性良好。

2.9 样品含量测定 取3批制首乌无糖颗粒样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行3份，按“2.2”项下色谱条件进行测定，按照外标法计算3批样品中大黄素和大黄素甲醚的含量，见表2。

表1 加样回收率试验结果

表2 3批样品中大黄素、大黄素甲醚含量测定结果(mg/g)

3 讨 论

3.1 提取溶剂、方法的选择 根据蒽醌类成分的理化性质，分别对提取方式(超声、回流法)、提取溶剂(甲醇、无水乙醇)、提取时间进行考察，结果当提取条件为：50 mL甲醇回流提取1 h时大黄素和大黄素甲醚的峰面积最大，故选择50 mL甲醇回流提取1 h。

3.2 流动相的选择 为了保证指标成分分离良好，参考2015年版《中国药典》(一部)中“制首乌”检查项目，考察不同体积比的甲醇-0.1%磷酸分离效果，结果表明流动相比例为甲醇-0.1%磷酸(80:20)时峰形良好，分离效果良好，阴性无干扰。

3.3 小结 现代研究表明二苯乙烯苷类化合物是制首乌提高免疫力、抗衰老等作用的药效物质基础，蒽醌类成分可能是制首乌致肝损伤的物质基础[4]。前期已经针对二苯乙烯苷建立质量标准，为了较为全面地控制该制剂的质量，本文建立制首乌无糖颗粒中两种主要蒽醌类成分的含量测定方法，为该制剂的质量评价提供新的参考。

[1] 雷载权.中药学[M].上海:上海科学技术出版社,1995:303.

[2]吴晓青.何首乌化学成分与药理活性的研究进展[J].时珍国医国药,2009,20(1):146-147.

[3] 魏宇峰,周国儿.人参首乌胶囊制备工艺的研究[J].中国生化药物杂志,2014,34(3):169-171.

[4]刘治军,李林,叶翠飞,等.二苯乙烯苷对脑缺血啮齿动物脑NMDA受体及细胞内钙离子的影响[J].中国药理学通报,2003,19(10): 1112-1115.

Simultaneous determination of emodin and physcion in sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu)by HPLC.

CHEN Cheng,ZHANG Cun-lao,LUO Guo-ping,CHEN Qi.College of Pharmacy,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo establish the method for determination of emodin and physcion in sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori(zhishouwu).MethodsThe high performance liquid chromatography(HPLC)analysis was performed on a Agilent 5TC-C18(150×4.6 mm,5 μm)with methanol-0.1%phosphoric acd solution(80:20)as the mobile phase:flow rate:1.0 mL/min;column temperature:25℃;detection wavelength:UV 254 nm.ResultsThe emodin and physcion respectively showed the good linear relationship with peak area within the range of 0.08-0.8 μg (r1=0.9998)and 0.04-0.4 μg(r2=0.9997).The average recoveries of samples were 100.04%and 99.58%,respectively, with the relative standard deviation(RSD)of 0.77%and 0.71%,respectively.The content of emodin in three samples were 0.159 mg/g,0.161 mg/g and 0.170 mg/g,and the content of physcion in three samples were 0.055 mg/g,0.064 mg/g and 0.072 mg/g.ConclusionThe method is accurate,with good specificity and good reproducibility,and can be used as one of the quality control methods for the sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori.

High performance liquid chromatography(HPLC);Sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori;Emodin;Physcion

R282.71

A

1003—6350（2017）03—0441—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.032

2016-04-26)

2014年陕西省自然科学基础研究计划项目(编号：2014JM4132)；西安医学院学科建设经费资助

张存劳。E-mail：1131168159@qq.com