母连胜，何勇，田志宏 长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025；主要粮食作物产业化

湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025

植物叶绿体遗传转化技术及应用研究进展

母连胜，何勇，田志宏 长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025；主要粮食作物产业化

湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025

叶绿体转化是植物基因工程中的新热点，叶绿体转基因通常具有较高表达水平，可以在操纵子中成簇串联，而且可以有效地防止外源基因的花粉逃逸。最近的研究逐步地扩展了人们对叶绿体基因工程的应用，许多实例表明，质体转化在作物遗传改良上有着巨大的潜力，同样在植物生物反应器的发展上也有巨大作用，可持续且高效益地生产生物医药、生物酶以及化工原材料。综述了叶绿体遗传转化技术的最新进展，重点阐述了叶绿体转化的表达调控及叶绿体转化技术的应用。

叶绿体转化；叶绿体基因工程；植物；质体

植物细胞具有3个基因组，并且在一些种子植物中，这些基因组中的2个，即核基因组和质体基因组(叶绿体基因组)是可转化的。叶绿体基因组主要是长度为120～220kb的共价闭合环状的双链DNA，编码120～130个基因[1]。目前，已有多种植物成功进行了叶绿体转化，这种可能性已经引起了人们极大的兴趣，因而质体基因组相对于核基因组具有更大的吸引力。首先，每个细胞有大量的叶绿体，每个叶绿体基因组有很高的拷贝数，可使外源基因达到非常高的表达水平，通常高于核基因组1到2个数量级[2,3]。其次，通过同源重组，可使外源基因定点整合到质体基因组中，叶绿体基因工程成为植物高度精确的遗传工程技术(通常通过非同源重组整合外源DNA进入核基因组)。第三，作为来源于通过内共生获得的蓝细菌的原核系统，质体遗传系统缺乏基因沉默和干扰稳定转基因表达的其他表观遗传机制。第四，类似于细菌基因，许多质体基因排列在操纵子中，具有通过将它们排列在人工操纵子中成簇串联转基因的可能性。最后，由于在大多数被子植物物种中，叶绿体是母性遗传，其大大降低了花粉的传播，从而较好抑制基因逃逸[4,5]，所以质体转化已经作为用于转基因抑制的有效工具，从而受到了极大的关注[6,7]。

自Boynton等[8]和Svab等[9]分别在1988年和1990年完成了莱茵衣藻和烟草叶绿体的遗传转化以来，叶绿体基因工程发展迅速，促进了其他植物叶绿体的转化。但目前叶绿体转化仍然限于相对少量的植物，且不仅仅是单子叶植物(包括代表世界上最重要主食的粮食作物)。因此，在叶绿体转化技术方面仍然面临着严峻的挑战，要做出突破，需要继续努力探究。为此，笔者对叶绿体转化技术的研究进展及其应用进行了综述。

1 叶绿体转化技术与过程

1.1 叶绿体转化方法

过去二十多年以来，叶绿体转化的基本方法没有改变。基因枪介导转化[10]仍然是主要的转化方法，聚乙二醇(PEG)介导[11]的原生质体转化偶尔替代使用[12]。相比较于基因枪法，PEG介导的叶绿体转化技术要求高，费力更费时，但是该方法具有的优点是不受专利保护，不依赖于组织培养方法的叶绿体转化技术(农杆菌侵染)更能被广泛应用。最近，在温室生长的烟草台叶绿体转化技术已经取得了一些进展，特别是利用靶向质体的噬菌体衍生的重组酶的位点特异性重组转移去除标记基因[13]。通过注射根癌农杆菌将重组酶导入到土壤中生长的烟草腋芽中，在切掉芽尖后，从注入的腋生分生组织侧枝常常形成具有无标记质体基因组的组织，子代中出现7%的无标记质体基因组。尽管该结果表明，通过用基因工程的质体靶向酶的核表达，在植物中至少可以进行质体DNA的一些改进操作，但通过不依赖组织培养方法获得质体转化的目标仍然难以实现。

1.2 选择标记基因

类似于DNA的转录程序，在过去的20a里获得转基因植株的筛选程序没有多大变化。壮观霉素抗性基因aadA编码氨基葡糖苷-3'-腺苷酰转移酶(具有壮观霉素和链霉素抗性)[14]仍然是叶绿体转化中最常用的选择标记基因[15]。虽然近年来，已经开发了几种替代的抗生素抗性标记基因[16～18]，它们似乎不如aadA有效，可能是因为它们需要更高的表达水平来赋予表型抗性。尽管如此，当考虑知识产权时，它们可以作为有吸引力的替代品，并且它们还代表有价值的工具用于超转化。

1.3 叶绿体基因组细胞间转移

目前叶绿体转化技术仍然限于相对较少的植物，开发新物种的转化体系需要大量的工作，用以优化组织培养、再生和筛选过程[19,20]。可用于叶绿体转化的重要模式植物(包括拟南芥)和农业上重要的主要作物(包括所有粮食作物)仍然缺乏有效体系，有时甚至转变为密切相关的物种或不同品种之间的转化都是有挑战性的[21]。改变建立一个新的转化方案是将转基因质体从易于转化的物种转移至不易转化的相关物种或栽培品种，这可以通过应用细胞生物学方法来完成，如原生质体融合，通过在原生质体融合实验(例如通过X-射线照射)中消除融合配偶体之一的核基因组来产生细胞(或胞质杂合体)。为了将转基因叶绿体与新核联合，转移原生质体的核基因组需要消除，并且在原生质体融合后，在转基因叶绿体抗性筛选下获得(野生型)质体与外来物种或品种的转基因质体的再生植物。这种方法已经被证明有效，但由于原生质体融合和原生质体植株再生过程中费力又耗时的苛刻过程，仅适用于少量的植物物种。

最近，已经开发了在植物之间转移转基因质体的更简单的方法。有个令人惊讶的发现，质体DNA(可能整个质体)可以在嫁接植物的细胞之间迁移[22～24]。由于可以嫁接不相容性的植物，该方法允许通过嫁接位点(在建立嫁接接合后)将转基因质体转移到不易转化植物的细胞中来完成植物之间的质体转化[25]，这种方法可能有助于扩大叶绿体转化技术的物种范围，但其适用性将限于密切相关的植物。核基因组与新质体基因型的组合可能导致所谓的质体基因组不相容性，其随着系统发生距离的增加变得更可能，并且可能导致严重的突变表型[26]。

2 叶绿体转化的表达调控

2.1 蛋白表达稳定元件

生物技术人员对叶绿体转化关注的主要原因在于通过从质体基因组表达转基因可获得非常高的外源蛋白积累水平，在极端情况下，可超过叶中总可溶性蛋白质的70%[27]。尽管许多情况下可以获得较高的表达率，但是重要的是要意识到，还有一系列的蛋白质在质体中的表达是有问题的，表达水平低或不可检测得到。虽然很少系统地研究转基因不成功表达的分子原因，但从实验的一些细节分析表明蛋白质稳定性的关键通常是限制外来蛋白质的积累[28]。即使相当充分地研究了在质体中的RNA转录和稳定性的调节，但是关于控制蛋白质稳定性的规则知之甚少。最近的跨膜系统研究已经揭示了N末端在确定叶绿体蛋白质稳定性中的重要作用。因此，操纵不稳定重组蛋白质的N末端或将它们融合到稳定蛋白质的N末端可以帮助缓解蛋白质稳定性[29]。然而，似乎不可能用不稳定的N末端来解释所有低外源蛋白积累的情况，内部序列模式或蛋白质的不正确折叠也可能引发蛋白质快速降解。目前不了解蛋白质稳定性的内在决定因素，控制在质体中表达的蛋白质可折叠性的规则也是难以捉摸的。因此，使重组表达的蛋白质稳定性在质体更可预测和如何稳定固有不稳定蛋白质提供指导是未来研究的主要挑战。

叶绿体转化技术的另一个吸引力涉及质体基因表达机器的原核性质，它提供了在操纵子中成簇串联多个转基因并从单个启动子作为多顺反子mRNA[30]共表达它们的可能性，这对于代谢途径的工程化(其通常需要多种酶的协同表达)特别有用。尽管在某些情况下操纵子表达已经成功[31]，但是在转化到叶绿体基因组中的操纵子构建体中还至少存在一些转基因差异表达的几个实例[32]。在细菌中，由操纵子制备的多顺反子mRNA直接进入翻译，但叶绿体中的许多多顺反子转录物必须经历转录后切割成单顺反子单位以促进翻译，特别是操纵子中下游顺反子的翻译。为了确保转基因操纵子的所有顺反子在质体中的可翻译性，可以包括将顺反子加工转化为稳定的单顺反子mRNAs[33]的小序列元件。IEE[34](反顺反子表达元件)是源自质体psbB操纵子中的加工位点，该元件为合成操纵子设计提供了有价值的作用，因为其大大增加了叶绿体转化中操纵子成功表达的机会。

2.2 非绿色组织中基因表达

叶绿体转化技术在非绿色组织(如水果、块茎和种子等)中基因表达水平很低。番茄果实和马铃薯块茎中的转录和翻译的全基因组分析揭示，在这些非绿色存储器官中几乎所有叶绿体基因的转录和翻译水平明显下调。有趣的是，虽然一些特殊的基因维持相对较高的mRNA水平但翻译水平较低(例如番茄中编码光系统II的D1蛋白的psbA基因)，另一小部分的特殊基因具有较低转录水平，但mRNA显示出较强的结合核糖体活性翻译(例如番茄中编码乙酰辅酶A羧化酶亚基的accD基因)。该观察表明在果实或块茎中高mRNA积累的基因的启动子和与多核糖表现出较强结合力的mRNA的50个非翻译区(50UTR，含有用于调节翻译起始的顺式元件)组合的可能性。实际上，这种混合表达元件的构建可使根、块茎和果实[35]中的转基因表达水平得到显著改善，并且因此为非叶状组织的叶绿体中的代谢工程和重组蛋白质生产开辟了新的机会。

2.3 诱导调控表达系统

改变质体中重组蛋白质产物的有害影响的策略是应用诱导调控表达系统，可通过核转基因容易实现，例如乙醇诱导型T7RNA聚合酶基因，其蛋白质产物靶向质体并转录束缚于T7启动子的质体转基因[36]。由于核转基因的使用移除了转基因组技术的控制优势，因此非常需要开发用于诱导型转基因表达的质体纯系统，提供严格控制和高感应速率的高效系统的设计是具有挑战性的，到目前为止，已经有2种选择：一是基于细菌lac抑制子和lac操纵子的系统[37]，其中通过用化学诱导物IPTG喷雾或叶浸润转录诱导基因表达；二是合成核糖开关诱导应答于天然化合物茶碱的应用的翻译[38]。值得一提的是，在转基因植物中纯化重组蛋白质的有效性和减少其成本效益的策略是叶绿体生物技术的重要应用方面。在这一领域的最新进展包括评价一些纯化标签和外源蛋白质成功靶向塑料球，这有助于通过浮选离心简单的富集重组蛋白。

有时，在叶绿体中转基因的表达导致严重的突变表型，导致延缓的生长，或在极端情况完全阻止自养生长。这可能具有不同的原因，可能是重组表达的蛋白质的酶活性影响叶绿体的代谢过程，外源蛋白质与叶绿体膜的有害相互作用或简单地由重组蛋白质的极端积累水平施加的高代谢负荷[39]。可以用2种可能的方式来处理转基因植物表现出极端表型的问题，一种较快的解决方案是在生物反应器中异养或混养植物(或其衍生的细胞培养物)。最近，已经开发了临时浸渍生物反应器，其有利于从表现出严重突变表型并因此难以在土壤中生长的转基因植物的生物制品的生产。生物反应器中的生物培养需要无菌条件和合成培养基，这使得其生物制品生产成本明显高于在自养条件下或是温室中植物的生产成本。然而，生物反应器代表高价值产品(例如昂贵的生物药物)的可行选择，其中生物制品生产的额外成本可忽略。此外，生物反应器提供了全部的控制条件，这对于某些产品可能是理想的，并且可简化转基因植物的控制条件。

3 叶绿体转化技术的新应用

叶绿体转化技术已广泛用于将抗性基因插入质体基因组中，使植物耐受除草剂或增强抗虫性[40,41]，表达用于疫苗分子农业中重组蛋白质和工程化代谢途径[42,43]，开发可能用作除草剂的D-氨基酸的叶绿体抗性基因[44]，以及抗氧化系统的酶的成功表达以增强对非生物胁迫的耐受性。尽管最初亚基疫苗的抗原是转质体系统技术在分子农业中的主要应用，但在过去的5a中，已经有很多的药物蛋白质在转基因质体中表达。这些蛋白质中的一些可以表现出很高的水平表达，比如一些噬菌体衍生的宿主可以提供新一代抗生素。

随着人类的开发利用和极端天气的增加，人们对植物在非生物逆境条件下生长和产量提高的要求也在增加，这就要求提高植物耐旱、耐极端温度和耐盐的能力[45]。渗透保护剂通过在渗透调节过程中稳定膜和蛋白能有效提高植物的耐盐和耐旱能力，但大多数植物不能直接利用，通过在植物体内引入编码渗透保护剂的相关基因显然是一个可行的办法。通过质体遗传转化在烟草叶绿体基因组中导入编码阿拉伯糖醇脱氢酶的ArDH基因，Khan等[46]获得了能正常生长于含350mmol/L NaCl土壤中的转化植株。Kumar等[15]利用质体转化技术在胡萝卜中引入并表达了编码甜菜碱脱氢酶的BADH基因，发现在含100mmol/L NaCl的培养基上，转化植株BADH的表达量比非转化植株提高了50～54倍，有效提高了转化植株的耐盐能力。通过增加不饱和脂肪酸含量来增强植物的抗氧化防御能力，或利用大肠杆菌panD基因编码的L-天冬氨酸脱羧酶将L-天冬氨酸分解为巴拉宁和CO2，可有效提高植物高温胁迫的耐受性[47]。

工业酶的表达已成为叶绿体生物技术的一个令人兴奋的新领域。随着对可再生能源日益增长的需求，生物燃料酶的生产已经受到特别强烈的关注。研究表明，很多可用于将纤维素产物转化为可发酵糖的酶可在叶绿体基因组表达出非常高的水平，例如各种纤维素酶[48]，以及木聚糖酶、葡糖苷酶、果胶酸裂解酶和角质酶。这些酶的一些基因取自嗜热生物，因此具有热稳定性质，这是用于以工业规模化处理纤维素产物的特别有用的特征。虽然目前对昂贵的木质纤维素产物的热酸预处理仍然是经济上可行的纤维素乙醇生产的主要障碍，但具有廉价的降解纤维素和半纤维素的酶是解决方案的重要组成部分。

使用转基因植物作为生产所谓“绿色化学品”的工厂也越来越受到关注，即化工原材料和积木。最近转基因烟草生产的聚羟基丁酸酯(PHB)，是一种可再生的生物塑料，其超过18%的干重代表了植物新陈代谢成功定向合成大量新化合物是特别引人注目的例子。PHB的高水平积累影响转基因植物的生长，但是这个问题可以通过PHB操纵子的诱导表达而有效地解决。

4 展望

经过近年来的不懈研究，叶绿体转化技术取得了巨大的进步。叶绿体转化技术作为分子水平上的一种技术手段，为植物基因工程的研究开辟了一个新的方向，但是成为生物技术的常规技术手段还需要一段时间，技术上的不足以及局限还应得到逐步完善。随着对叶绿体基因工程的进一步探索与研究，叶绿体基因工程将会在作物遗传改良、工农业及生物反应器等多个方面发挥巨大的作用。具有高水平重组蛋白表达和多基因工程的巨大进展对该技术的商业化具有很大帮助，虽然来自转基因植物的产品尚未进入市场，特别是在制药领域，预期叶绿体转基因的商业市场将很快到来。

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[编辑] 余文斌

2017-04-24

主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心开放基金项目(2015MS006)。

母连胜(1991-)，男，硕士生，研究方向为水稻遗传与基因工程。通信作者：田志宏，zhtian@yangtzeu.edu.cn。

Q812

A

1673-1409(2017)14-0052-06

[引著格式]母连胜，何勇，田志宏.植物叶绿体遗传转化技术及应用研究进展[J].长江大学学报(自科版) ，2017，14(14)：52～57.