姬妍茹， 刘 玉， 杨庆丽， 刘宇峰, 石 杰， 董 艳， 张正海,2

(1.黑龙江省科学院 大庆分院， 黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院， 黑龙江 大庆 163319)

一株产黑色素黑蒜发酵菌的分离与鉴定

姬妍茹1， 刘 玉1， 杨庆丽1， 刘宇峰1, 石 杰1， 董 艳1， 张正海1,2

(1.黑龙江省科学院 大庆分院， 黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院， 黑龙江 大庆 163319)

黑色素是一类由植物或者微生物产生的色素，在食品、化妆品和医药领域具有广阔的应用前景。从黑蒜发酵96 h样品中筛选出1株产黑色素的细菌S8nyzx-1，对菌株进行形态学和分子生物学鉴定，采用紫外可见分光光谱和红外光谱扫描测定其所产黑色素特性，并进行短时耐高温能力测试。结果表明，在LB培养基上，菌落边缘较整齐，表面干燥，有褶皱，白色不透明，周围有少量棕色色素产生，16S rDNA测定核苷酸序列为1 419 bp，与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)同源性达99.8%。具有短时耐高温能力，可耐受93 ℃水浴10 min。由紫外分光光度法测得S8nyzx-1所产黑色素在370～390 nm左右有一个较强吸收峰；红外光谱分析黑色素具有吲哚结构的吸收峰，结合该菌可利用L-酪氨酸的特性，推测其为真黑色素。

枯草芽孢杆菌； 黑色素； 黑蒜； 鉴定； 红外光谱

黑色素是一类由微生物或者动植物产生的棕色或者黑色色素，是一种非均质的类多酚聚合体，结构复杂。黑色素具有抗紫外线、抗氧化、防衰老、清除自由基的特性。产黑色素的细菌种类较多，来源广泛。一是来源于土壤的菌种，Aghajanyan等[1]从土壤中分离到的苏云金芽孢杆菌可产生水溶性黑色素，Tarangini等[2]分离并鉴定的土壤微生物沙福杆菌。二是来源于海水的菌种，Ganesh等[3]从红色海藻中分离出一株施氏假单胞菌，朱琳等[4]从山东近岸海水中分离得到一株产黑色素细菌S1初步鉴定为明亮发光杆菌 (Photobacteriumphosphoreum)。三是来源于毛发的菌种，张丽香等[5]从人的头发样品中筛选出1株产黑色素枯草芽孢杆菌ZH168，并对其产的胞外黑色素进行了红外光谱分析，确定所产黑色素为真黑色素。目前没有关于来源于植物大蒜的产黑色素细菌的报道。

黑蒜是由生蒜在控制环境温、湿度条件下自然发酵而成的食品。加工过程主要包括低温和高温两个熟化阶段。高温熟化阶段主要包括Maillard反应，焦糖化反应等，卜利伟等[6]建立了加工时间与5-HMF含量关系的一级反应动力学方程，初步揭示了Maillard反应对白蒜变为黑蒜的贡献，并说明利用该动力学模型可以对黑蒜成熟与否和黑蒜品质做出评判；低温熟化阶段主要发生的是酶促反应，也是生蒜褐变的主要因素[6]。此阶段温度适合大蒜内部微生物的生长，产生的次生代谢产物可能会对大蒜的熟化和褐变有一定促进作用，因此对黑蒜加工过程中微生物的活动情况进行研究非常必要。

目前，针对生大蒜内生菌的研究有少量文献报道，都是涉及拮抗菌筛选方面的内容。邓振山等[7]从大蒜鳞茎中分离出63株内生菌并筛选出4株对番茄灰霉病具有离体防效的菌株；崔北米等[8]利用常规方法对大蒜鳞茎进行内生菌分离，获得19株内生细菌，菌株DSP6对供试的9种病原菌有较强的抑菌作用，经16S rDNA鉴定为芽孢杆菌属的Bacillusaxarquiensi。国内外有关黑蒜工艺及功效方面的文献较多，但是还没有涉及发酵过程中微生物分离筛选方面的报道。本实验拟从加工过程的黑蒜样品中进行微生物的分离和筛选，以期获得能够产黑色素的菌株。一方面丰富产黑色素菌种资源，另一方面为进一步揭示黑蒜的形成机理提供数据佐证，为开发黑蒜发酵菌剂奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜为市售白皮分瓣蒜，购于黑龙江省阿城市，清选剥皮后装入厚塑料袋内，然后置于单位自主研制的发酵设备中进行黑蒜加工，按不同时间点取出样品用于实验。

培养基：PDA培养基[9]，LB培养基[9]，添加L-酪氨酸的LB培养基(简称L-Tyr)。

细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂盒，上海生工生物公司；DNA Marker 564bp/21226bp、柱式DNA胶回收试剂盒，上海生工生物公司；合成多巴黑色素(dihydroxypheny-lalanine，DOPA)标准品购自Sigma公司，其他试剂均采用国产分析纯。

BSC- 1360ⅡA2型生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；DYY- 5型电泳仪，北京六一仪器厂；FR980型凝胶像系统，上海复日科技仪器有限公司；PCR仪，东胜创新科技有限公司；BK- 5000型电子显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；LDZX- 40SCI型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗仪器厂；HPX- 9082MBE型数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HZQ- X100型振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；UV- 759型紫外可见分光光度计；IR- 960型傅立叶变换红外光谱仪，天津瑞岸科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产黑色素细菌的分离和纯化

取不同加工阶段的黑蒜样品，表面灭菌后，在无菌条件下磨碎后称量5 g，加入45 mL无菌水中充分摇匀，吸取1 mL梯度稀释后涂布到上述3种培养基上，置于30 ℃恒温培养，选择周围颜色变黑的菌落划线纯化，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的分子生物学鉴定

PCR扩增方法参照文献[10]进行，扩增产物委托上海生工生物工程技术有限公司进行基因测序。

1.2.3 黑色素特性分析

黑色素的制备参照文献[11]进行。将发酵液离心后取上清液适当稀释，在200～900 nm范围内进行紫外可见光谱扫描分析；黑色素粉末经KBr处理压片后进行红外光谱扫描分析，红外光谱范围为500～4 000 cm-1。

1.2.4 产黑色素菌株耐高温测试

将产黑色素菌株活化后，以1%体积分数接入PDA液体培养基中，30 ℃振荡培养24 h，93 ℃水浴处理10 min,水浴处理前后均涂板计数，比较前后菌种数量变化情况。

2 结果与分析

2.1 S8nyzx-1菌株的分离及其产黑色素条件

从黑蒜加工过程中第96 h的样本中分离到1株细菌S8nyzx-1。S8nyzx-1在不同培养基上菌落和细胞形态见图1。

图1 S8nyzx-1菌落、细胞形态及发酵液Fig.1 Melanin, clony morphology and microscopy morphology of S8nyzx-1

在LB平板上培养48 h后，观察到的菌落特征为边缘较整齐，表面干燥，有褶皱，白色不透明，周围有少量棕色色素产生(图1a)。在添加L-Tyr的固体培养基上产生的棕色色素颜色加深(图1b)，这一点与张丽香等[5]报道的从毛发中分离的枯草芽孢杆菌表现一致。在PDA培养基上菌落生长旺盛，可产生较多胞外黑色素(图1c)。菌株革兰氏染色呈阳性，细胞杆状，有芽孢(图1d)。在参试的3种液体培养基中，只在PDA培养基中产黑色素(图1e)说明葡萄糖或者马铃薯中的某种成分对黑色素的产生起重要的作用。

2.2 S8nyzx-1菌株的16S rDNA鉴定

对S8nyzx-1菌株进行16S rDNA基因扩增，结果见图2。

M为分子质量标记；1，2列为S8nyzx-1的菌株DNA

由图2可知，片段长度在1 375～1 584 bp，经测序为1 419 bp，输入NCBI进行BLAST 比对，与Bacillussubtilissubsp. Subtilis的多个菌株相似度达99.8%，可确定S8nyzx-1菌株属枯草芽孢杆菌菌群。

2.3 S8nyzx-1菌株短时耐高温能力

黑蒜生产工艺为齿变式加热，加工初期温度缓慢上升，然后在75～93 ℃反复波动[12]，如果想利用该菌株作为发酵辅助剂，则要求其有一定的短时耐高温能力，以保证在黑蒜生产初期起到促进发酵和变黑的作用。

应用Excel 2003软件对S8nyzx-1菌株高温水浴处理前后活菌数的对数值做出柱形图，结果见图3。

图3 S8nyzx-1菌株93 ℃ 水浴10 min前后活菌数变化Fig.3 Changes of viable count in 93 ℃ water bath 10 min of strain S8nyzx-1

由图3可知93 ℃高温虽然在一定程度上抑制S8nyzx-1菌株的生长，但活菌数量仍可达到(1×106～1×107)CFU/mL,尤其在PDA液体培养中生长状态更好。

2.4 S8nyzx-1菌株产黑色素特性分析

图4 S8nyzx-1菌株黑色素紫外吸收图谱Fig.4 Ultraviolet absorb curve of melanin from strain S8nyzx-1

对S8nyzx-1菌株所产黑色素进行紫外可见光谱扫描，并应用Excel 2003软件将数据制成曲线图，结果见图4。由图4可见，黑色素在可见光波长范围内无特征峰，呈现出吸光度随波长增大逐渐减小的趋势，这一点与合成黑色素极为相似，所不同的是S8nyzx-1菌株所产黑色素在紫外光区的强吸收峰出现在370～390 nm处，而合成黑色素在210 nm左右，这可能是因为两种黑色素中所含有的生色团和助色团有所不同[13]，这一点从文献资料中可以得到印证。例如李建波等[14]分离的奇异变形杆菌T4菌株所产黑色素在300～800 nm波长范围内无极值，阎春兰等[15]从土壤中分离的链霉菌属D-1菌株所产黑色素在可见光区域没有特征吸收峰，但在240～250 nm处有一个强吸收峰。

图5 S8nyzx-1菌株黑色素红外吸收图谱Fig.5 Infrared absorb curve of melanin from strain S8nyzx-1

图6 黑色素标准品红外吸收图谱Fig.6 Infrared absorb curve of melanin from standard for melanin

3 结论与讨论

从黑蒜发酵96 h大蒜瓣样品中筛选出1株产黑色素的细菌S8nyzx-1，经形态学鉴定和16S rDNA序列测定结果表明该菌属于枯草芽孢杆菌菌群。S8nyzx-1菌株在相同的培养条件下，在L-Tyr固体培养基上产生黑色素的情况明显好于LB固体培养基，说明该菌发酵所产黑色素以酪氨酸为底物，加之红外光谱扫描显示该菌具有典型的吲哚结构吸收峰，因此初步推测为真黑色素。S8nyzx-1菌株无论是在固体和液体的PDA培养基均能良好生长，产生较多的胞外黑色素。将该菌株回接到生蒜上，在低温熟化阶段可加速黑色素的产生(已有实验研究，数据在此没有体现)，说明马铃薯和大蒜中的营养成分对黑色素的产生起着重要的作用。S8nyzx-1菌株具有短时耐高温能力，经93 ℃高温水浴处理10 min仍能较好地生长，可以考虑作为黑蒜发酵菌开发使用。

随着人们健康理念的增强，对食品添加剂的来源及安全性要求越来越高。天然色素以其健康安全、富含营养、多功能的特点逐渐取代了合成色素的位置。黑色素具有清除自由基、抗氧化和预防衰老等功能，在黑色食品倍受推崇的今天尤其受到重视。本实验中筛选到的S8nyzx-1菌株来源于大蒜内部，健康安全，又能利用马铃薯和葡萄糖等低成本原料产黑色素，值得对其发酵条件进行深入研究和优化，为食用黑色素的开发提供新的资源。

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(责任编辑：李 宁)

Solation and Identification of Melanin Producing Bacteria from Fermented Black Garlic

JI Yanru1, LIU Yu1, YANG Qingli1, LIU Yufeng1, SHI Jie1, DONG Yan1, ZHANG Zhenghai1,2

(1.DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,Daqing163319,China；2.CollegeofLifeScienceTechnology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China)

Melanin is produced by plants or micro-organisms, and has broad application prospects in the food, cosmetics and medicine. Bacteria S8nyzx-1 that can produce melanin was isolated from black garlic of 96h fermented. The strain was identified according to colony morphology and molecular biology. The structure characteristic of this melanin was identified using the techniques of UV and IR spectroscopy，and high temperature ability for a short time was determined. The results showed the colony was neat edges, white opaque, dry surface, wrinkled, and surrounded by a small amount of brown pigment on LB. 16S rDNA fragment (1 419 bp of size) was 99.8% of similarity withBacillussubtilis. The strain had a high ability of survive 10 min at 93 ℃ water bath. The melanin had strong absorption peak at 370-390 nm through UV and with the indole structure through IR, which was considered for eumelanin according the characteristics of the bacteria can use L-tyrosine.

Bacillussubtilis; melanin ; black garlic; identification; FT-IR

2015-11-11

黑龙江省科学院大庆分院促进“三年行动计划”功能食品平台项目(PB15F004)。

姬妍茹，女，副研究员，主要从事食品生物技术方面的研究。

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.009

2095-6002(2017)01-0059-05

姬妍茹，刘玉，杨庆丽，等. 一株产黑色素黑蒜发酵菌的分离与鉴定[J]. 食品科学技术学报，2017,35(1):59-63. JI Yanru, LIU Yu, YANG Qingli, et al. Solation and identification of melanin producing bacteria from fermented black garlic[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(1):59-63.

TS201.3

A