张 炫， 程镜蓉， 唐道邦， 张友胜， 张业辉， 刘学铭，*

(1.广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610;2.江西农业大学 生物科学与工程学院， 江西 南昌 330045)

米曲霉发酵鸡血血红蛋白制备小分子肽条件的优化

张 炫1，2， 程镜蓉1， 唐道邦1， 张友胜1， 张业辉1， 刘学铭1，*

(1.广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610;2.江西农业大学 生物科学与工程学院， 江西 南昌 330045)

研究了米曲霉发酵鸡血血红蛋白(Hb)制备小分子肽的优化工艺条件，并测定了多肽分子质量的分布。在单因素实验基础上选出影响Hb多肽得率最主要的因素，并以多肽得率作为响应值，应用响应面法优化发酵工艺；通过凝胶色谱方法检测Hb多肽分子的分布范围。结果表明，接种量、培养温度、起始pH值和装液量为影响Hb得率最主要的因素，其优化工艺为接种量7.9%，培养温度30.2 ℃，起始pH值7.01，装液量61 mL，Hb多肽得率由最初的1.85 mg/mL提高到2.18 mg/mL；采用HPLC凝胶色谱法测定Hb多肽分子质量，其范围主要集中在1 000～6 500 u，且在1 600～2 500 u段多肽含量最多，占总量的38.39%。

凝胶色谱法； Hb多肽； 响应面法； HPLC

据美国农业部统计，2014年全球鸡肉产量在8 529.2万t左右，而中国鸡肉的年产量为1 270万t，位居世界第二[1]。大批活鸡宰杀的同时会产生大量的副产物——鸡血。由于鸡血血腥味重、适口性差、不易储藏，这些鸡血并没有真正利用起来。鸡血是一种营养价值很高的功能性食品，含大量的蛋白质、丰富的氨基酸以及微量元素、维生素、酶类和其他一些生物活性物质[2]。鸡血中的血红蛋白质(Hb)占全血蛋白质的65%以上。近年来，许多研究者利用生物酶水解Hb从中分离出ACE抑制肽[3-4]、抗氧化肽[5]、抗菌肽[6]等生物活性肽，无疑为Hb的高值化利用提供了一个很好的方向。

目前，将Hb转化为小分子多肽的方法主要有化学法、酶解法以及微生物降解法。化学法因水解程度不易控制、副反应多、营养破坏严重等原因，已很少应用于生产Hb多肽。日前，大部分研究利用生物酶水解Hb获取Hb多肽[7-8]，但是生物酶法降解率低、成本高，而微生物降解投入低、操作简单、降解效果好[9]，为制备Hb多肽提供了一个好的研究方向。当前国内对微生物发酵降解Hb制备多肽的研究报道较少。

米曲霉是公认的食品安全菌株，能产生多种蛋白酶，尤其是碱性蛋白酶和中性蛋白酶[10]。本研究选用1株主要产碱性蛋白酶的米曲霉作为出发菌株，通过单因素实验，确定影响米曲霉发酵鸡血制备多肽的主要条件，采用中心组合试验设计和响应面法(RSM)分析其优化的发酵工艺；利用凝胶过滤色谱法测定发酵液中多肽分子质量的分布， 旨在为制备Hb多肽提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

GIM3.236米曲霉，购于广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂与仪器

1)主要试剂。细胞色素C，纯度95%以上；抑肽酶，纯度99%以上；杆菌肽，USP级；Gly- Gly- Tyr-Arg，纯度97%以上；Gly- Gly- Gly，纯度NT级，以上标准品均购自美国Sigma公司。三氯乙酸(TCA)、Folin-酚试剂，其他试剂均为分析纯。

2)主要仪器。Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪，FOSS分析仪器公司；1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；UV- 1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.1.3 培养基及其培养条件

斜面培养基：PDA琼脂培养基。

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，NaCl 2 g/L，蒸馏水，pH值调至7.5。摇瓶种子培养条件：将10 mL无菌水倒入斜面，轻轻刮起斜面孢子，倒入装液100 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min培养24 h。

Hb发酵培养基：葡萄糖15 g/L，Hb粉10 g/L，KH2PO4·3H2O 2 g/L，NaCl 4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.001 g/L，MnSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl20.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，VB10.001 g/L，APG-2000 0.1 g/L，pH值调至7.5，无菌水。

1.2 Hb粗粉的制备方法

新鲜鸡血中添加柠檬酸钠5 g/L，置4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清液，下层沉淀加等体积生理盐水洗涤2次，再加等体积超纯水超声波仪中溶胀破壁10 min，静置10 min；在4 ℃、6 000 r/min离心15 min，弃沉淀获上清液，真空冷冻干燥得到Hb粉[11]。

1.3 分子质量检测方法

1)色谱法。TSKgel G2000SWXL型色谱柱(300 mm×7.8 mm)，流动相为乙腈、水、三氟乙酸，体积比为10∶90∶0. 1；流速为0.5 mL/min；检测波长为UV 220 nm；柱温为30 ℃；进样体积为20 μL。

2)样品的处理。采用流动相配制标准品；样品先用15 g/L三氯乙酸(TCA)与发酵液上清液等体积混合，静置30 min，再离心去除杂蛋白；用两倍浓度的流动相与上述溶液等体积混合，0.22 mm滤头过滤制备1 mL的样品。

1.4 测定方法

1.4.1 酶活的测定

Folin酚法[12]。将发酵液抽滤，滤去菌体，常温下6 000 r/min离心15 min，得到的上清液即粗酶液；以添加pH值为8.5的磷酸盐缓冲液的酪蛋白溶液为底物，在40 ℃、pH值为8.5的条件下，将碱性蛋白酶每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(见式(1))，酶活力单位以U/mL表示。

酶活力=(A×K)/(t×V) ，

(1)

式(1)中，A为样品测得的OD值根据标准曲线求得的酪氨酸质量浓度，μg/mL；K为稀释倍数；t为反应时间，min；V粗酶液的体积，mL。

1.4.2 氨基氮的测定

氨基氮(游离氨基酸以及一些寡肽)用中性甲醛滴定法[13]测定。

1.4.3 TCA法测非蛋白氮

TCA法测非蛋白氮(主要指肽类物质以及游离氨基酸)。在酶水解液中加入等体积的12.5 g/L的TCA溶液，混匀后静置20 min，10 000 r/min、4 ℃离心20 min，用凯氏定氮仪测量上清液中非蛋白氮的含量[14]。

1.4.4 可溶性氮的测定

将发酵液抽滤、离心得到的发酵液上清液即为可溶性氮样品，用凯氏定氮法测量。可溶性氮包括氨基氮、非蛋白氮以及易溶于水的蛋白质。

1.5 单因素实验

1.5.1 发酵时间的确定

考察不同的培养时间对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响，在接种量6%、装液量60 mL、起始pH值为7.5、转速150 r/min、28 ℃条件下分别培养2，3，4，5，6，7，8 d取样。

1.5.2 接种量的确定

向斜面倒入无菌水，将米曲霉孢子悬液置于种子液培养24 h。取10 mL种子液洗涤、105 ℃干燥2 h称重，反复3次，测得的米曲霉质量浓度为8.4 g/L。以此为基准，考察不同的接种量2%，4%，6%，8%，10%五个水平对米曲霉制备小分子肽的影响。在装液量60 mL、起始pH值为7.5、转速150 r/min、28 ℃条件下培养3 d。

1.5.3 发酵温度的确定

考察不同的发酵温度对米曲霉制备小分子肽的影响。分别设定了26，28，30，32，34 ℃五个水平，在接种量6%、装液量60 mL、起始pH值为7.5、转速150 r/min条件下培养3 d。

1.5.4 摇床转速的确定

考察不同的摇床转速对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响。选取转速90，120，150，180，200 r/min 五个水平，在接种量6%、装液量60 mL、起始pH值7.5、28 ℃条件下培养3 d。

1.5.5 装液量的确定

考察不同的装液量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响。选定40，60，80，100，120 mL五个水平，在接种量6%、起始pH值7.5、转速150 r/min、28 ℃条件下培养3 d。

1.5.6 起始pH值的确定

考察不同的起始pH值对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响。选取起始pH值分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0七个水平，在接种量6%、装液量60 mL、转速150 r/min、28 ℃条件下培养3 d。

1.6 响应面设计

根据单因素实验结果，选取影响米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子的最主要因素，采用BOX-Behnken试验设计和响应面分析实验数据。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 培养时间对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

培养时间对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图1。由图1可见，随发酵时间的推移，pH值迅速升高，到3 d时达到最大值8.7，随后开始缓慢下降；而碱性蛋白酶活力也在第3天达到最大值，其后酶活力明显降低，多肽的得率3 d时最大，随后开始减少。此结果的原因是，米曲霉在生长过程中释放出碱性蛋白酶水解Hb，到第3天多肽的得率最高，随着发酵时间的延长，发酵环境的变化使得酶活力开始下降，且米曲霉菌体的增加利用大部分的多肽，其得率反而呈下降趋势；直至发酵8 d时，生长环境恶劣，菌体开始自溶，释放出自身的含氮物质，使得氨基氮、非蛋白氮以及可溶性氮的含量明显增加；发酵后期会产生一些含氮类的次级代谢产物，对多肽的品质会有一定的影响[15]。因此，选择3 d为较佳发酵时间，考虑到培养3 d和4 d后发酵液中多肽得率的变化不大，所以后面响应面优化没有考察培养时间。

图1 培养时间与米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的关系Fig.1 Effect of culture time on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.2 接种量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

图2 接种量与米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的关系Fig.2 Effect of inoculation on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

接种量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图2。由图2可知，随着接种量的增加，发酵液中可溶性氮的含量增加明显，酶活力上升趋势显著。多肽的得率为8%时，多肽的得率最高，呈现先增加后下降的趋势，说明接种量的多少直接影响米曲霉菌体浓度，进而影响米曲霉的产酶量和多肽得率。接种量过少，碱性蛋白酶分泌较少，致使Hb水解率低，多肽得率相应减少；接种量过多时，米曲霉生长旺盛，会吸收大量的肽类水解物，反而使多肽的得率不高。因此8%接种量为最适接种量。

2.1.3 培养温度对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

培养温度对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图3。由图3可知，随温度的升高，发酵液中含氮量和酶活力都呈现先升高后下降的趋势，在30 ℃时，米曲霉发酵鸡血产小肽的得率最高。低温抑制米曲霉的生长，产酶减少以及对酶的活性也有抑制作用，导致多肽的得率不高；温度过高同样会抑制米曲霉的生长繁殖，影响多肽的得率，因此30 ℃为最适发酵温度。

图3 培养温度与米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的关系Fig.3 Effect of culture temperature on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.4 摇床转速对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

摇床转速对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图4，由图4可知，摇床转速对米曲霉发酵制备多肽的影响不显著(p>0.05)。转速增加并没有提高发酵液中多肽的得率，酶活力也没有明显的变化趋势。霉菌通风发酵的需氧量比较小，在实验转速范围内，对于菌丝体生长及产酶影响很小。因此摇床转速快慢对米曲霉制备小分子肽影响不明显，该因素不宜作为响应面考察因素。

图4 摇床转速与米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的关系Fig.4 Effect of rotation speed on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.5 起始pH值对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

起始pH值对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图5。由图5可知，发酵培养基起始pH值对米曲霉制备小分子肽有显著(p<0.05)影响。随起始pH值的升高，米曲霉碱性蛋白酶的活力出现先增后降的趋势，多肽的得率亦如此，并在起始pH值为7.0时多肽的得率最高。低的起始pH值对米曲霉的生长不利，延长米曲霉的延滞期，米曲霉分泌碱性蛋白酶较少，酶活力低，导致多肽得率低；当起始pH值为7.0时多肽得率最高；继续提高起始pH值，其发酵条件越来越接近米曲霉的最适生长环境，米曲霉生长繁殖旺盛，酶活力提高的同时也吸收利用大部分肽类物质，反而使得多肽得率降低，说明优良的环境利于菌体生长但不利于产物积累。因此起始pH 值为7.0是制备多肽较佳的条件。

图5 起始pH值与米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的关系Fig.5 Effect of initial pH on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.6 摇瓶装液量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响

摇瓶装液量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽影响的实验结果见图6。由图6可知 ，随装液量的增加，碱性蛋白酶的活力一直呈现增加的趋势，但多肽的得率呈先增后降趋势。装液量主要影响的是通风量，所以与摇床转速的影响是相关的，60 mL以下时，通风量足以供给霉菌生长和产酶，但是装液量提高，就会影响微生物生长，从而影响产酶。因此60 mL是获取多肽的较佳装液量。

图6 装液量对米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽的影响Fig.6 Effect of medium volume on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.2 响应面优化结果与分析

2.2.1 BOX-Behnken试验结果

根据单因素实验结果，选取对多肽得率影响比较显著的几个因素：接种量、培养温度、起始pH值和装液量，进行四因素三水平的响应面优化试验，以Hb多肽得率为响应值。利用Design-Expert V8.0.6对实验结果进行分析，见表1。

2.2.2 模型的建立与显著性检验

采用Design Expert软件对数据进行多元回归拟合，其二次多项回归模型为：多肽得率=0.340-2.33×10-3A+5.92×10-3B+4.17×10-3C+4.75×10-3D-8.50×10-3AB-0.013AC+7.50×10-3AD-0.014BC-5.25×10-3BD-0.014CD-0.025A2-0.035B2-0.031C2-0.018D2。

此模型的方差分析如表2，模型是极显著，失拟项不显著，相关系数R2>0.9，模型的拟合度较好。因此该模型可以用于米曲霉发酵鸡血Hb制备小分子肽条件优化的理论预测。由表2可以得出，各发酵条件对Hb多肽得率影响由大到小的顺序：培养温度、装液量、起始pH值、接种量，且接种量和起始pH值、培养温度和起始pH值以及起始pH值和装液量之间的交互作用显著(p<0.05)，其他交互项不显著(p>0.05)。

表1 BOX-Behnken试验设计与结果

2.2.3 响应面结果分析

发酵条件中各因素对Hb多肽得率的交互作用如图7至图12。结合表2可以得出，图8、图10和图12中等高线较紧密、呈椭圆，说明两因素间交互作用显著(p<0.05)；图7、图9以及图11中等高线接近圆形，两因素间的交互作用不显著。从图7可看出，其等高线接近圆形，交互作用不明显，说明Hb多肽得率对两因素之间的变化影响较小。图8显示，当pH值为某一固定值时，接种量的改变对Hb多肽得率的影响较大；反之，当接种量为某一固定值时，pH值的变化对Hb多肽得率的影响较小，这说明多肽得率对接种量的变化比对起始pH值的变化更加敏感[16]。

图9显示，响应面图中的等高线接近圆形，交互作用不显著(p>0.05)，说明Hb多肽得率对接种量和装液量之间的变化影响不明显。图10显示，当pH值为某一固定值时，培养温度的变化对Hb多肽得率的影响较大；当培养温度为某一固定值时，起始pH值的变化对Hb多肽得率的影响较小，说明Hb多肽得率对培养温度的变化比对起始pH值的变化更加敏感。

表2 试验结果的方差分析

图7 接种量和培养温度对Hb多肽影响的响应面图Fig.7 Response surface for effect of inoculum and culture temperature on yield of Hb peptides

图8 接种量和起始pH值对Hb多肽影响的响应面图Fig.8 Response surface for effect of inoculum and initial pH on yield of Hb peptides

图9 接种量和装液量对Hb多肽影响的响应面图Fig.9 Response surface for effect of inoculum and medium volume on yield of Hb peptides

图10 培养温度和起始pH值对Hb多肽影响的响应面图Fig.10 Response surface for effect of culture temperature and initial pH on yield of Hb peptides

图11 培养温度和装液量对Hb多肽影响的响应面图Fig.11 Response surface for effect of culture temperature and medium volume on yield of Hb peptides

图11显示其等高线接近圆形，交互作用不明显，说明Hb多肽得率对培养温度和装液量之间的变化影响不显著(p>0.05)。图12显示，当pH值为某一固定值时，装液量的变化对Hb多肽得率的影响较小；当装液量为某一固定值时，pH值的变化对Hb多肽得率的影响较大，说明Hb多肽得率对起始pH值的改变比对装液量的变化敏感。

图12 起始pH和装液量对Hb多肽影响的响应面图Fig.12 Response surface for effect of initial pH and medium volume on yield of Hb peptides

从响应面结果分析得出，起始pH值是影响Hb多肽得率的主要因素。为得到优化的工艺参数，对此模型方程求一阶偏导，获得较佳发酵工艺条件为：接种量7.94%，培养温度30.15 ℃，起始pH值7.01，装液量60.92 mL，Hb多肽得率的模型预测值是0.336 mg/mL。

2.2.4 验证实验

在响应面试验得到的优化发酵工艺条件下进行实验，重复3次，Hb多肽得率为0.348 mg/mL，与模型预测值相近，说明建立的模型是合理的。米曲霉发酵条件优化后，其Hb多肽得率提高了约0.05 mg/mL。

2.3 Hb多肽分子质量的测定

图13 多肽样品的凝胶色谱图Fig.13 Gel chromatograms of peptides sample

多肽标品的凝胶色谱图见图13，其标品中细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、Gly- Gly- Tyr-Arg以及Gly- Gly- Gly的质量浓度分别为0.2，0.2，0.2，0.02，0.2 mg/mL，横坐标表示出峰时间(min)。发酵液中Hb多肽的凝胶色谱见图14。将样品的出峰时间与标品进行对比得出，样品中Hb多肽分子质量的大小主要集中在1 600～5 000 u，其中多肽分子质量在1 600～2 500 u含量最多，占总峰面积的38.39%,具体结果见表3。根据标品中一个波峰表示一种物质，比较得出多肽样品中波峰数量较少，其原因可能是样品经过4倍稀释后，单个种类的多肽分子含量稀释得更少，导致多肽样品相差一两个氨基酸的色谱图分离效果不太明显，从多肽标品凝胶色谱图中的杆菌肽和Gly- Gly- Tyr-Arg可以得出。

表3 样品出峰时间及其分子质量大小

图14 Hb多肽分子质量凝胶色谱图Fig.14 Molecular weight gel chromatograms of peptides sample

3 结 论

通过单因素实验，确定了接种量、培养温度、起始pH值和装液量为影响Hb得率最主要的因素。采用Box-Behnken 试验对发酵条件进一步优化，得到优化条件为，接种量7.9%、培养温度30.2 ℃、起始pH值7.01、装液量61 mL，Hb多肽得率由最初的1.85 mg/mL提高了0.32 mg/mL；通过HPLC凝胶色谱法测定Hb多肽分子质量，其范围主要集中在450～6 500 u，且分子质量在1 600～2 500 u组分含量多达38.39%。分子质量在330～450 u占17.07%，利用米曲霉降解鸡血Hb可以获得分子质量为330～1 500 u的生物活性肽。

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(责任编辑：叶红波)

Optimization of Fermentation Conditions of Chicken Blood Hemoglobin for Preparation of Small Peptides byAspergillusoryzae

ZHANG Xuan1,2, CHEN Jingrong1, TANG Daobang1, ZHANG Yousheng1,ZHANG Yehui1， LIU Xueming1,*

(1.SericulturalandAgri-FoodResearchInstitute，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofFunctionalFood，MinistryofAgriculture/GuangdongKeyLaboratoryofAgriculturalProductsProcessing，Guangzhou510610，China；2.CollegeofBioscienceandBioengineering，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

The fermentation conditions of chicken blood hemoglobin (Hb) for the preparation of small peptides byAspergillusoryzaewere optimized and the molecular weight distribution of the polypeptides were determined. On the basis of single factor experiments, response surface analysis methodology (RSM) were used to optimize the preparation conditions about Hb polypeptide. A regression model for Hb polypeptide yield was established to optimize the fermentation process and the distribution of Hb polypeptide molecular weights were determined by the gel chromatography method. The results showed that factors affected the Hb polypeptide yield were inoculation amount, culture temperature, initial pH, and the fluid volume. The optimal conditions were inoculation amount 7.9%, culture temperature 30.2 ℃, initial pH 7.01, and medium volume 61 mL. Under these conditions, Hb polypeptide yield increased from 1.85 mg/mL to 2.18 mg/mL. According to the gel chromatography method, the Hb peptide molecular weights were mainly concentrated in the range of 1 000-6 500 u, of which 1 600-2 500 u took up the most abundant (38.39%).

gel chromatography methods； Hb polypeptide； response surface method； HPLC

2016-01-05

广东省科技计划项目(2014A020208046)；广东省促进科技服务业发展计划项目(2013B040400009) 。

张 炫，男，硕士研究生，研究方向为微生物发酵与代谢工程；

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.008

2095-6002(2017)01-0050-09

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TS251.93； S873

A

*刘学铭，男，研究员，博士，主要从事畜禽水产加工方面的研究，通信作者。