顿珠加才，张俸伟，夏小婷，宋恩亮，陈 宏，雷初朝*

(1.西藏农科院草业科学研究所，西藏 拉萨 850009；2.西北农林科技大学动物科技系统，陕西 杨凌，712100；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东 济南 250100)

[目的] 分析西藏牛和日喀则驼峰牛的Y染色体遗传多样性及父系起源。[方法] 采用PCR扩增、测序及生物信息学方法。[结果] 通过对13头西藏牛Y-SNPs分析，发现西藏牛包含普通牛Y1、Y2及瘤牛Y3三种单倍型组，其频率分别为0.077、0.846和0.077；对8头日喀则驼峰牛Y-SNPs的分析表明，日喀则驼峰牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3两种单倍型组，其频率分别为0.125和0.875。西藏牛和日喀则驼峰牛的单倍型多样度分别为0.2949±0.1558和0.2500±0.1802，表明西藏牛和日喀则驼峰牛具有较低的父系遗传多样性。[结论] 西藏牛主要为普通牛Y2起源，日喀则驼峰牛主要为瘤牛Y3起源，且其遗传多样性较低。

西藏牛；日喀则驼峰牛；Y-SNPs；遗传多样性；父系起源

西藏地处我国西南部，平均海拔高，自然环境恶劣，气候复杂，但有较多的草甸草场，适合放牧和农业种植。西藏地区牛种资源丰富，拥有耐高耐寒的特性，能适应高海拔和严酷的自然气候[1]。西藏牛是西藏地区特有的黄牛品种，具有适应高海拔缺氧环境和粗放饲养管理的特征，但存在体型小和生产性能低的缺点。目前对于西藏牛生理生化水平的研究较多，而关于其Y染色体分子遗传多样性及父系起源的研究较少[2]。日喀则驼峰牛是近代日喀则地区的农牧民自发地从印度、尼泊尔、不丹等地引入的瘤牛公牛与当地的黄牛杂交，经过长时间的选育，逐渐形成的独特类群，与当地黄牛相比有很明显的优势，如体格较大、产乳性能增加[2]。但是对于日喀则驼峰牛的父系起源研究尚未见报道。本文利用家牛两个Y-SNPs(ZFY10和UTY19)标记对西藏牛和日喀则驼峰牛进行分子遗传多样性研究，以期从分子水平上探究西藏牛和日喀则驼峰牛的Y染色体分子遗传多样性、父系起源和群体结构，为西藏牛和日喀则驼峰牛的遗传资源保护和利用提供理论依据，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样本的采集及基因组DNA的提取

在西藏自治区日喀则市定结县萨尔乡采集13头西藏牛公牛耳组织样本，在日喀则市附近和定结县陈塘镇采集8头日喀则驼峰牛公牛的耳组织样本，用试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)方法提取基因组DNA，并将其稀释到10 ng/μL，保存在-20℃备用。

1.2 引物的合成和PCR扩增

参考Götherström 等[3]、Ginja等[4]发表的家牛Y-SNP标记，合成2对引物(UTY19和ZFY10)(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为12.5 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 6.25 μL，上下游引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1μL，超纯水5.25μL。PCR反应程序为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸30 s，36个循环，4℃保存。PCR扩增产物由2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 西藏牛和日喀则驼峰牛Y染色体UTY-19和ZFY-10标记的PCR信息

1.3 PCR产物测序、单倍型分型及单倍型多样度计算

检验合格的PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems)进行正反向测序，使用Chromas 2.3软件对测序结果进行检测，并用Bioedit 7.0.9软件进行分析，利用 Arlequin 3.0 软件进行单倍型多样度(H±SD)计算。

2 结果与分析

通过对西藏日喀则市2个黄牛品种西藏牛和日喀则驼峰牛的两个Y-SNPs标记(UTY19和ZFY10)的测序分析，结果显示，2个Y-SNPs标记在13头西藏牛和8头日喀则驼峰牛中具有明显的多态性(表2)。参考Götherström 等[3]、Ginja 等[4]对家牛Y染色体单倍型组判定的标准，可知13头西藏牛中有1头为普通牛Y1单倍型组，1头为瘤牛Y3单倍型组，其余11头为普通牛Y2单倍型组，Y1、Y3和Y2单倍型组个体所占频率依次是0.077、0.846和0.077，表明西藏牛有3种Y染色体单倍型组，以Y2单倍型组为主，Y1和Y3单倍型组为辅，西藏牛的Y染色体单倍型多样度为0.2949±0.1558。在8头日喀则驼峰牛中，1头为普通牛Y2单倍型组，其余7头为瘤牛Y3单倍型组，Y3和Y2单倍型组个体所占频率依次是0.875和0.125，日喀则驼峰牛的单倍型多样度为0.2500±0.1802，表明日喀则驼峰牛有2种Y染色体单倍型组，以Y3单倍型组为主，Y2单倍型为辅。

表2 西藏牛和日喀则驼峰牛Y染色体单倍型组类型，频率及单倍型多样度

3 讨论

Y染色体分子标记(Y-SNPs和Y-STRs)被广泛应用于国内外家牛的父系遗传研究中， Edwards等[5]分析了欧洲和亚洲138个品种2087头牛的Y染色体分子遗传多样性，发现欧洲牛为普通牛Y1和Y2两种父系起源，亚洲西南部为瘤牛Y3父系起源。常振华等[6]用4个Y-SNPs标记对16个地方牛品种进行研究，结果表明北方黄牛以普通牛Y2单倍型组为主，南方黄牛以瘤牛Y3单倍型组为主，中原黄牛既含有普通牛Y2单倍型组，也含有瘤牛Y3单倍型组。赵晓诚等[7]用UTY19和ZFY10两个标记对30头岭南黄牛进行研究，结果表明岭南黄牛的父系起源以瘤牛为主，普通牛为辅。

从起源上讲，西藏牛是原牛迁移到西藏地区，而未向西方迁移，保留下来的古老牛种[8]。西藏牛主要产区在西藏雅鲁藏布江中下游、喜马拉雅山东段和三江流域下游地区及毗邻的草甸草场，尤以拉萨、林芝、昌都、山南市分布最多。据我们调查，日喀则市也有西藏牛分布，对日喀则市定结县的西藏牛未见研究。本文通过对西藏牛两个Y-SNPs的分析，表明该品种中以单倍型Y2为主，单倍型Y1与Y3为辅，据此推测西藏牛以普通牛Y2父系起源为主，其单倍型多样度为0.2949±0.1558，这个结果与Li 等[9]对16个中国地方黄牛品种的平均单倍型多样度0.6830±0.0130相比较，表明西藏牛父系遗传多样性较低。雷初朝等[10]，罗永发等[11]的研究都将西藏牛归类到北方黄牛类型中，而常振华等[6]的研究表明北方黄牛以单倍型组Y2为主，所以普通牛单倍型组Y1的出现，推测是由于引进的西方牛品种(如安格斯、荷斯坦牛等品种)与西藏牛杂交导致的雄性基因渗入所致；西藏牛单倍型组Y3的存在，表明定结县西藏牛与日喀则驼峰牛存在一定程度的杂交。

日喀则驼峰牛属于西藏地区的牛种，其起源受到印度、尼泊尔、不丹等地引入的瘤牛公牛的影响，拥有瘤牛血统[2]。杨章平等[12]通过对西藏南部高寒地区瘤牛群体形态及生态特征的研究，发现我国西藏瘤牛和云南瘤牛之间可能存在血缘关系。罗永发等[11]的研究表明，日喀则驼峰牛由于受到瘤牛血缘渐渗的影响，而与其他普通牛品种的遗传距离很远。通过对日喀则驼峰牛两个Y-SNP的结果分析，推测日喀则驼峰牛有两个父系起源，主要以瘤牛单倍型组Y3为主，普通牛单倍型组Y2为辅。这与中国畜禽遗传资源志·牛志中日喀则驼峰牛形成的历史吻合。日喀则驼峰牛的单倍型多样度为0.2500±0.1802，低于Li等[9]对16个中国地方黄牛品种的平均单倍型多样度0.6830±0.0130，表明日喀则驼峰牛的父系遗传多样性较低。

[1] 陈智华, 邓晓莹. 西藏牦牛和黄牛遗传多态性的研究[J]. 西南民族大学学报(自然科学版), 1999,(3): 274-277.

[2] 国家畜禽遗传资源委员会编著. 中国畜禽遗传资源志·牛志[M].北京:2011.

[3] Götherström A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences, 2005, 272(1579):2345.

[4] Ginja C, da Gama LT, Penedo MCT. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. Journal of Heredity, 2009, 100(2):148-157.

[5] Edwards CJ, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming--evidence from a comprehensive survey of European Y-chromosomal variation[J]. Plos One, 2011, 6(1): e15922.

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[12] 杨章平, 常洪, 李相运, 等. 西藏南部高寒地区瘤牛群体形态及生态特征研究[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2002, 23(1): 23-26.