杜小正 袁博 王金海 方晓丽 张星华 田亮 张婷卓 李兴兰 曾华宗

摘要：目的 通过测定寒证类风湿关节炎（RA）模型家兔滑膜组织内源性代谢物，探讨热补针法治疗RA的特异性机制。方法 采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制寒证RA模型。将40只清洁级青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。除正常组和模型组外，其余各组分别施以平补平泻、捻转补法、热补针法针刺“足三里”，1次/d，留针30 min，连续7 d。干预结束后分离家兔膝关节滑膜组织，应用气相色谱-四级杆飞行时间质谱采集各组滑膜代谢物谱图，利用主成分分析和偏最小二乘判别分析对数据进行统计。结果 与正常组比较，模型组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于三羧酸循环、糖类及脂肪酸代谢相关物质增高（P<0.05）；与模型组比较，各针刺组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于上述各种代谢相关物质降低（P<0.05），且热补针法组三羧酸循环与糖代谢相关物质明显低于平补平泻组和捻转补法组（P<0.05）。结论 热补针法治疗RA的特异性体现在对三羧酸循环及糖代谢通路的调控。

关键词：热补针法；类风湿关节炎；滑膜组织；代谢组学；气相色谱-质谱法；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.015

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0055-05

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎为主的慢性自身免疫性疾病，该病病程迁延、反复发作，对患者的生活造成严重影响。针灸疗法具有抗炎、免疫调节等作用[1-3]，对RA具有确切的临床疗效[4-5]。热补针法是郑魁山教授简化烧山火手法和进火法而形成的一种复式手法，具有补益正气、温阳散寒之功用。课题组前期研究表明，热补针法治疗RA在镇痛方面具有相对特异性[6-9]，但这些初步研究尚不能体现针灸多靶点、多途径、多层次、类似于网络结构的作用特点，缺乏对针刺后机体产生的全部生物信息的综合分析。

代谢组学是一门新兴的系统生物学，通过考察生物体系在外因刺激下其代谢路径及代谢产物的变化，从系统生物学角度研究机体发病及治疗机制的新技术[10-11]。该研究手段的优势与针灸作用特点甚相吻合。为了进一步深入研究热补针法治疗RA的特异性机制，课题组前期以寒证RA模型家兔为载体，对家兔尿液内源性代谢物进行了分析[12]。本实验进一步观察热补针法干预对家兔模型关节滑膜组织代谢物的影响，从系统生物学角度探讨热补针法治疗RA的特异性机制。

1 材料与方法

1.1 动物

2～3月龄清洁级健康青紫蓝家兔40只，雌雄各半，体质量（2.5±0.5）kg，兰州生物制品研究所，动物许可证号SCXK（甘）2012-0001。饲养于温度（20±2）℃，相对湿度（50±10）%，每日光照时间12 h，自由进食饮水。

1.2 针具、主要试剂与仪器

针灸针（华成牌，苏州东邦医疗器械有限公司）。卵蛋白干粉（批号A5253-250G）、弗氏完全佐剂（批号F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，国药集团；尿素酶、甲氧胺盐酸吡，Sigma公司。Agilent GC/MS系统、毛细管色谱柱，J&W; Scientific公司。

1.3 分组及造模

家兔适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。采用卵蛋白诱导联合低温冷冻进行RA寒证模型复制[13-14]。实验正式开始前3 d，剃去家兔背部肩胛骨间的毛。将4 mg/mL卵蛋白溶液与等量弗氏完全佐剂混匀，充分震荡成乳化剂，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均匀选定的6个点，每点皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔双后腿膝关节周围的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒双膝关节，关节内注入20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL。24 h内膝关节出现红肿触痛，表明模型复制成功。成模后第2日，乙醇消毒两后腿足，上、下、左、右围置冰袋，温度降至-20～-25 ℃冷冻1.5 h，45 ℃温水复温5 min。冷冻后14 d，家兔表现为精神萎靡不振，两后肢匍伏跛行，膝关节肿胀、周径明显大于正常组，局部青紫、皮温不高，表示成功建立RA寒证模型。

1.4 针刺方法

先将家兔固定，选取后腿“足三里”[15]。各针刺组分别施以相应针法。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[16]：左手拇指紧按穴位，右手持针刺入穴内8～12 mm，针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次；针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次；拇指再向前连续捻按5次，反復操作1 min；最后使针下沉紧，留针30 min。平补平泻法、捻转补法操作参照《刺法灸法学》[17]。平补平泻法：针刺得气后，前后均匀捻转，不单向捻转，指力均匀，角度180～360?，频率60～90 r/min，反复操作1 min。捻转补法：针刺得气后，小幅度前后捻转针体（角度180～360?，频率60～90 r/min），拇指向前左转时用力重、指力沉重向下，拇指向后右转还原时用力轻，反复操作1 min。每日1次，每次留针30 min，连续7 d。

1.5 样本采集

针刺干预结束后，耳后缘静脉注射空气处死家兔，分离各组家兔双侧膝关节滑膜组织，于冻存管内置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 样品衍生化处理

室温解冻后，取100 μL样本于1.5 mL EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品∶甲醇=1∶4，涡旋30 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取200 μL上清液，转入进样小瓶中待测。将进样小瓶置于温和氮气下吹干，加入30 μL甲氧胺吡啶（20 mg/mL）溶液，剧烈震荡30 s，37 ℃肟化反应90 min，取出后加30 μL BSTFA（含1%TMCS）进行衍生，70 ℃反应60 min，室温静置30 min备检。

1.7 气相色谱-质谱条件

进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度>99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50～550 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免仪器信号波动所造成的影响。

1.8 统计学方法

在R软件平台下采用XCMS软件对GC/MS数据进行预处理，并在Excel2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（保留时间、质荷比）、观察量（样本）和峰强。然后将所有数据归一化到总信号积分。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P13.0进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），最后获得差异物质。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原始色谱图的可视化检查

每组样本的离子流色谱图（TIC）见图1。仪器的保留时间重现性良好，仪器稳定，因而提高了仪器分析和数据结果的可靠性。

结果显示，模型组滑膜组织代谢物变化较正常组主要体现于三羧酸循环、糖类及脂肪酸代谢的代谢物升高（P<0.05）；各针刺组代谢物变化较模型组主要体现于脂肪酸代谢各种代谢相关物质降低（P<0.05），且各针刺组间差异无统计学意义（P>0.05），各针刺组干预后三羧酸循环、糖类代谢相关代谢物下调，且热补针法组三羧酸循环与糖代谢相关物质如柠檬酸、乌头酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、乳酸、牛磺酸明显低于平补平泻组和捻转补法组（P<0.05）。

3 讨论

RA是一种以关节滑膜炎为主要病理改变的自身免疫性疾病，滑膜炎是RA中重要的病理改变，与血液、尿液比较，关节滑膜组织代谢物信息的变化可能更能准确、灵敏地反映RA的发病机制。有研究发现，在RA机体内能量代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、葡萄糖代谢等发生了变化[18-20]，本实验发现RA与三羧酸循环、糖类及脂肪酸代谢相关，与上述研究相符，表明RA的发病机制涉及途径广、层次多等复杂的网络系统。因此，从现代医学角度而言，其发病机制与针灸多靶点、多途径、多层次、类似于网络结构的整体作用特点亦甚相符。

自由基理论认为，其亲核氨基可与水分子作用产生大量的自由基，造成细胞膜和线粒体等氧化应激性损伤[21]，自由基的增多，会引起脂质氧化代谢紊乱、线粒体损伤等一系列连锁反应，最终造成细胞膜的损伤，癸二酸、壬二酸、亚麻酸作为不饱和脂肪酸，其含量升高就是脂质过氧代谢的表现，本實验结果验证了这一说法。线粒体的损伤会引发三磷酸腺苷（ATP）的合成障碍。本实验发现，模型组琥珀酸、柠檬酸、乌头酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸的含量增加，这些物质均是三羧酸循环的中间产物，三羧酸循环是糖的有氧代谢的主要途径，它与催化糖的有氧分解等相关的酶分布在线粒体基质中，线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，它为细胞的活动提供了能量。因此，这些代谢物的异常变化反映了线粒体功能的损害[22]。

细胞膜的损伤可诱发炎症反应，RA是一种以滑膜炎为主的疾病，有人认为与RA相关的白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6等促炎性细胞因子[23-24]具有多种促炎作用，可刺激前列腺素E的产生，而前列腺素作为花生四烯酸的代谢产物，其含量在RA发生后含量会增加，从而使其前体物质花生四烯酸的含量降低。本实验结果显示，模型组花生四烯酸含量较正常组下降、前列腺素E2甲酯升高，与上述描述相一致。

正常生理状态下，葡萄糖在无氧情况下，经糖酵解途径分解成乳酸，并释放出少量能量，乳酸成为这一糖酵解过程的最终产物；牛磺酸是机体非必需氨基酸之一，是体内一种重要的含硫氨基酸，它一般以游离形式存在于人及动物组织细胞和体液中，牛磺酸参与糖代谢的调节，加速糖酵解。本实验发现模型组乳酸和牛磺酸含量较正常组增加，提示RA滑膜组织糖酵解活性增强，这与文献报道一致[25]。

RA属中医学“痹证”范畴。正气虚弱是RA发病的内因，风寒湿邪侵犯是外因，风寒湿邪乘虚侵入四肢关节筋骨，阳气虚不能驱邪外出，邪气黏滞缠绵，闭阻经络，发为此病。因此，中医治疗须标本同治，在祛散邪气的同时兼顾温补阳气，即为“阳气并则阴凝散”。热补针法是郑魁山教授临床治疗RA的经验结晶，具有补益正气、温阳散寒的作用。从中医角度而言，热补针法的功用与RA的病机特点相吻合。

综上，针刺干预后参与脂肪酸代谢的上述物质普遍下调，且各针刺组间差异无统计学意义（P>0.05），提示针刺对RA具有抗氧化损伤及抗炎的作用；针刺干预后参与三羧酸循环及糖代谢的上述代谢物均显著降低（P<0.05），尤以热补针法组下调明显（P<0.05），说明热补针法可能通过修复线粒体功能损伤（ATP合成受限）、改善糖酵解来调节RA的三羧酸循环及糖代谢。

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（收稿日期：2016-02-03）

（修回日期：2016-03-01；编辑：华强）