林江丽，王金霞，张雪霞，王吉德

(新疆大学 化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

RP-HPLC法测定SO2处理前后新疆无核葡萄干中的B族维生素

林江丽，王金霞，张雪霞，王吉德*

(新疆大学 化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

建立了高效液相色谱同时测定SO2处理前后无核葡萄干中4种B族维生素(VB1,VB2,VB3和VB6)的分析方法。考察了流动相组成、pH值及梯度洗脱程序对分离效果的影响。最终采用pH 4.4缓冲溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，4种B族水溶性维生素的线性范围为0.1～20 mg/L，r2>0.999，检出限为0.013～0.064 mg/L，方法的平均回收率为83.0%～101.4%，相对标准偏差为0.6%～4.8%。同时利用该法对SO2处理前后无核葡萄干中4种维生素含量的影响进行研究。结果表明，空白无核葡萄干中VB6的含量最大，VB1含量较低；但SO2处理对葡萄干中VB1的含量影响最大，其它3种B族维生素的含量变化不大。该方法简便，快速，准确性和重现性均较好，可用于葡萄干中B族维生素的测定。

高效液相色谱；SO2处理；B族维生素；葡萄干

新疆无核白葡萄是最重要的制干品种[1]，其品质优良、营养丰富，具有补血气、抗衰老、抗氧化和消炎等功效[2-5]，应用开发前景广阔。葡萄干除了富含人体所需的营养物质如氨基酸、葡萄糖等物质外，还含有丰富的水溶性维生素[6-9]，其中维生素的含量对葡萄干的品种有重要影响。B族水溶性维生素是人体正常生理活动必不可少的物质，其摄取量缺乏会引起严重的疾病，人体严重缺乏VB2和VB3时，常表现为口角炎、皮炎、腹泻和痴呆等症状，缺乏VB1会导致脚气病[10]。新疆无核葡萄在干制过程中常添加一定量的SO2及其盐类来抑制果粒褐变并延长其货架期，但添加的SO2及其盐类易与维生素等物质发生化学反应[11]，这不仅增加了SO2的残留量，而且直接影响葡萄干的品质。

目前对于水溶性维生素分析检测的方法有分子荧光法[12-13]、微生物法(MBA)[14-15]、毛细管电泳(CE)[16-17]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[18-20]和高效液相色谱法(HPLC)[21-24]等。高效液相色谱法因其分离速度快，样品前处理简单，样品用量少而广泛应用于水溶性维生素的分离分析，其分析研究对象多为样品基质相对简单的维生素片和液态样品(如蜂蜜、饮料)中维生素的测定。但目前，国内外采用HPLC法对经SO2处理的无核葡萄干中B族维生素的相关研究鲜有报道。

本文采用RP-HPLC法对新疆无核葡萄干中的4种B族水溶性维生素(VB1，VB2，VB3和VB6)进行分析，同时考察了SO2处理对无核葡萄干中4种B族水溶性维生素的影响，并对样品前处理和色谱条件进行了优化。旨在对无核葡萄干的品质评价提供理论参考，同时也对SO2处理的食品中B族维生素的质量监控提供技术支持。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

空白葡萄干为采摘后的无核葡萄在无任何添加的情况下避光自然阴干；商品葡萄干为市售。

SO2处理葡萄干：100 g空白葡萄干置于干燥器中，称取5.0 g偏重亚硫酸钠于50 mL烧杯中，加入50%硫酸20 mL，产生的SO2气体对空白葡萄干样品进行熏蒸处理7 d后，取出葡萄干样品密封置于-80 ℃保存待测。

乙腈(色谱纯，Dikma公司)，VB1,VB2,VB3,VB6对照品(纯度≥99%,阿拉丁试剂有限公司)；磷酸二氢钾为国产分析纯；实验用水为电阻率18.2 MΩ·cm的高纯水。

1.2 仪器与设备

SPD-20A型高效液相色谱仪(岛津公司)；PHB-8型笔式pH计(上海佑科仪器仪表有限公司)；Coulter Avanti J-25型高速离心机(美国Beckman公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Classic UF型纯水仪(韩国Classic UF公司)；FW-80型高速粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)；微孔滤膜0.22 μm(上海兴亚净化材料厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制准确称取VB1，VB2，VB3和VB6标准品各0.002 5 g，用pH 2.5的HCl溶液分别定容于25.00 mL容量瓶中，分别配成各维生素质量浓度为100.0 mg/L的储备液，用锡箔纸作避光保存，放置4 ℃冰箱中。检测前根据需要配成不同质量浓度的混标溶液。

1.3.2 样品前处理条件的优化向低温保存的葡萄干样品中加入液氮使样品低温均质化。称取均质化的葡萄干样品6.00 g置于50 mL具塞三角瓶中，准确加入25.00 mL pH 2.5的HCl溶液密封。调节浸提液pH值范围为1.0～4.0，浸提温度为10～50 ℃，超声时间为10～40 min。浸提液高速离心10 min(10 000 r/min)，上清液定容至25.00 mL容量瓶中。

取1.00 mL样液，加入0.1 g聚酰胺吸附剂，高速离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，待测。

1.3.3 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4.6 mm,5.0 μm)，流动相：A为乙腈，B为一定pH值的缓冲溶液；流速:0.6 mL/min，柱温：室温；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 浸提液pH值对B族维生素提取量的影响考察了浸提液pH值(1.0，2.0，2.5，3.0，4.0)对样品中4种B族水溶性维生素提取量的影响。结果表明，随着浸提液pH值的增大，VB1提取量逐渐减小，当pH 1.0时其提取量最大；VB2和VB6提取量逐渐增大，当pH 3.0时两种维生素的提取量均达到最大值；VB3的提取量先增大后减小，当pH 2.0时其提取量最大。综合上述因素，pH 3.0为VB2和VB6的最佳提取pH值，但该条件下不利于VB1的提取，pH 2.0为VB3的最佳提取条件，且VB1，VB2和VB6的提取量均较大。为了最终确定浸提液的pH值，考察了pH 2.0和3.0两种不同浸提液中4种B族水溶性维生素的提取量、回收率及相对标准偏差(RSD)。从表1可看出，pH 2.0和3.0时，4种维生素的测定结果比较接近，平均回收率为89.2%～103.7%，RSD不大于4.6%，该结果说明pH 2.0和3.0时4种维生素均能被充分提取。为了保证样品中VB1的充分提取且不影响其它维生素的提取量，确定采用pH 2.0的浸提液对样品中的4种维生素进行浸提。

表1 pH 2.0和pH 3.0时葡萄干中4种B族维生素的提取量、平均回收率和RSDs(n≥3)

2.1.2 浸提温度对B族维生素提取量的影响考察了浸提温度(10，20，30，40 ℃)对样品中4种B族维生素提取量的影响。图1结果显示，随着温度的升高，VB1的提取量逐渐降低；VB2的提取量逐渐增大，VB3的提取量先增加后减小，30 ℃时其提取量达到最大值；VB6的提取量逐渐增加，30 ℃后其提取量几乎不变。综合考虑，本实验选择20 ℃对样品各维生素进行提取。

2.1.3 超声时间对B族维生素提取量的影响考察了超声时间(10，20，30，40 min)对样品中4种维生素提取量的影响。结果显示，随着超声时间的增加，VB1和VB6的提取量逐渐增大，而VB2和VB3的提取量先增大后减小，当超声时间分别为20 min和30 min时，VB2和VB3的提取量达到最大值。综合考虑，本实验最终选择30 min对样品各维生素进行提取。

图2 pH 4.4时4种B族维生素的色谱图Fig.2 Chromatogram of of four B-vitamins at pH 4.4

2.2 色谱条件的优化

调节和控制流动相pH值是优化分离条件的重要因素。调节流动相pH值(4.0～5.6)，对4种维生素混标溶液进行分析。结果显示，流动相pH 4.4时，4种B族水溶性维生素的分离效果最好(见图2)，因此确定流动相最佳pH值为4.4。

流动相的组成是优化分离条件的另一重要因素。等度洗脱对于基质较为复杂的葡萄干样品中的4种B族水溶性维生素不能实现较好的分离分析。因此须采用梯度洗脱来调节流动相的极性，以改善样品中待分析组分的分离效果。通过对样品中干扰物与目标物，以及4种目标物之间的相互分离的结果进行分析，最终确定的梯度洗脱程序为：0～2.0 min，98%B，2.0～20.00 min，80%B，20.00～30.00 min，98%B。

2.3 方法学及性能评价

2.3.1 线性范围与检出限配制一系列不同浓度的4种维生素混标溶液，进行液相色谱分析。以峰面积(Y)对维生素的质量浓度(X，mg/L)作图，得到关系曲线。以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限，其线性关系与检出限结果见表2。结果表明，4种B族水溶性维生素在一定浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 2，检出限均不大于0.064 mg/L，说明此方法可应用于样品中维生素的定量分析。

表2 4种B族维生素的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(n≥3)

2.3.2 回收率与相对标准偏差取6.0 g商品葡萄干样品，按照“1.3.2”方法进行样品前处理，分别添加维生素VB1，VB2，VB3和VB6标准品适量，每个添加水平测定3次，进行回收率与精密度实验，结果见表3。4种维生素的平均回收率为83.0 %～101.4 %，相对标准偏差(RSD)为0.6 %～4.8 %，方法的准确度与精密度满足定量分析的要求。

表3 4种B族维生素的回收率及相对标准偏差(n≥3)

图3 标准品(A)与样品(B)的色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of standards(A) and real sample(B)

2.4 实际样品的测定

依据优化后的色谱条件测定无核葡萄干中4种B族水溶性维生素的含量，样品色谱图和标准品色谱图见图3，测定结果见表4。从表4可以看出，空白葡萄干(无任何添加自然阴干无核葡萄干)和商品葡萄干中均检出4种B族维生素，其中空白葡萄干中VB6的含量最高，达到13.96 mg/kg，VB1的含量最低，仅为2.16 mg/kg。

表4 葡萄干中4种B族维生素的含量(n≥3)

2.5 SO2处理对目标物的影响

在最佳色谱条件和样品提取条件下，分别对SO2处理前后的无核葡萄干样品中的4种B族水溶性维生素进行分析，结果见表4。由表4可以看出，葡萄干中添加SO2对4种B族水溶性维生素的含量影响程度不同，SO2处理对无核葡萄干中的VB1含量影响最为显著，而对其它3种B族维生素含量的影响不大。空白和商品无核葡萄干中VB1的含量分别为2.16 mg/kg和2.01 mg/kg，而SO2处理后的无核葡萄干样品中未检出VB1。该实验结果与文献报道SO2及其盐类易与VB1发生化学反应的观点相一致[13]。上述结果说明，富含VB1的食品中不能采用添加SO2及其盐类作为抗氧化剂和抑菌剂。

3 结 论

由于葡萄干中B族维生素的含量直接影响葡萄干的品质，对葡萄干中B族水溶性维生素含量的准确测定对于葡萄干营养价值的评定具有重要意义。因此建立了高效液相色谱法测定新疆特色干果无核葡萄干中4种B族水溶性维生素含量的分析方法。该方法在一定浓度范围内相关系数、线性范围、检出限、回收率及RSD均较好。同时利用该法对SO2处理前后的无核葡萄干中的4种B族水溶性维生素进行定量分析。实验结果表明，SO2处理对无核葡萄干中的VB1含量影响较大。该方法的建立对食品中B族水溶性维生素的分析检测提供了技术支持。

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Determination of B-Vitamins in Xinjiang Currants Treated with SO2by RP-HPLC

LIN Jiang-li，WANG Jin-xia,ZHANG Xue-xia,WANG Ji-de*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

A RP-HPLC method was developed for the determination of four B-vitamins(VB1,VB2,VB3，VB6) in currant after treated with SO2.The effects of mobile phase,pH value and gradient elution procedure on chromatographic separation were studied.The mobile phase was a mixture of pH 4.4 buffer solution and acetonitrile.Under the optimal conditions,the detection limits of four B-vitamins in currants were in the range of 0.013-0.064 mg/L.The linear ranges were between 0.1 mg/L and 20 mg/L with correlation coefficients(r2) larger than 0.999.The average recoveries for the method were in the range of 83.0%-101.4%while RSDs were in the range of 0.6%-4.8%.At the same time,the contents of these vitamins before and after treated with SO2were investigated.The results showed that the content of VB6in currant was the highest and that of VB1was lower.But the change of VB1content in currant treated with SO2was the largest,and the contents of other three species of B-vitamins changed very little.The method showed the advantages of simplicity,rapidness,accuracy and reproducibility,and was suitable for the determination of B-vitamins in currants.

high performance liquid chromatography(HPLC);SO2;B-vitamins；currants

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.021

2016-08-13；

2016-09-20

新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2013211A015)

*通讯作者：王吉德，博士，教授，研究方向：应用化学，Tel:0991-8582807,E-mail：xjuwangjd@163.com

O657.72；O629.4

A

1004-4957(2017)01-0122-05