孙伟华，杨 欢，曹赵云，马有宁，秦美玲，柴爽爽，陈铭学

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)

基于分散固相萃取液相色谱-串联质谱法测定大米中8种真菌毒素

孙伟华，杨 欢，曹赵云，马有宁，秦美玲，柴爽爽，陈铭学*

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)

建立了大米中HT-2毒素、T-2毒素、伏马毒素B1、伏马毒素B2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉毒素B1共8种真菌毒素的快速测定方法。比较了3种基于分散固相萃取原理的样品前处理方法(即QuEChERS方法、EMR-lipid方法以及DisQuE方法)对8种真菌毒素的回收率；以提取后加标法考察大米基质中各目标物LC-MS/MS分析的基质效应。结果表明，QuEChERS样品前处理方法不适于伏马毒素B1、伏马毒素B2和赭曲霉毒素 A分析；而EMR-lipid样品前处理方法无法消除玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素 A在大米中的基质效应。据此采用DisQuE方法并优化LC-MS/MS分析参数，一次进样监测16对离子对(每个化合物2对离子对)分析大米中的8种真菌毒素残留量。8种真菌毒素在3个添加水平下的回收率为70.0%～124.1%，相对标准偏差为0.9%～16.9%，检出限(S/N≥3)为1.2～60.0 μg/kg。该方法准确、灵敏，适用于大米中多种真菌毒素的快速分析。

QuEChERS方法;EMR-lipid方法;DisQuE方法;LC-MS/MS;真菌毒素;大米

真菌毒素(Mycotoxin) 是由霉菌等真菌产生的有毒的次生代谢产物，也称霉菌毒素，可广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性产品[1-2]，其中对农产品和食品的污染最为严重。目前在自然界中已发现有400多种真菌毒素，其中最为关注的有黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)、展青霉素(Patulin)、赭曲霉毒素(Ochratoxin,OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、伏马毒素(Fumonisin,FB)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、T-2毒素等[3]。研究表明，这些真菌毒素不仅会对食品有影响，如导致食品霉败变质、营养物质损失及品质降低，还对人和动物造成极大危害，抑制其体内DNA，RNA，蛋白质和各种酶类的合成、破坏细胞结构并引起真菌毒素中毒[4-5]。部分真菌毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用[4,6-8]。据联合国粮农组织(FAO)统计，每年全球农产品污染率高达25%，损失达10亿吨；据我国国家粮食局统计，每年有3 100万吨粮食在生产、储存、运输的过程中受到真菌毒素污染，约占粮食年总产量的6.2%[9-10]。粮食及其制品作为人类不可或缺的主要食物和动物饲料的主要来源，真菌毒素的污染越来越受到关注。许多国家在近几十年来陆续制定并颁布了诸多相关的法律法规和毒素限量标准，以确保人类的食物安全[4-5]。

由于对真菌毒素的强制限量规定和各项监控措施的实施，强力促进了真菌毒素检测方法的发展。与其他众多的真菌毒素检测方法相比，液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)可以通过保留时间和破碎离子共同完成定性定量分析，具有准确、稳定、可靠等特点，其中最显著的技术优势是多组分、多类别真菌毒素的同时分析检测，是一种灵敏度和选择性极高的真菌毒素检测方法[11-12]。但由于粮食种类多、成分复杂、理化性质各不相同、在特定条件下可能会发生相互作用，产生基质干扰。因此，样品前处理通常采用免疫亲和柱[13]、多功能净化柱[14-16]、固相萃取柱[17-18]、凝胶色谱法等净化方法[19]，但这些方法成本高、操作繁琐、工序复杂，不利于大量样品中多种毒素的同时分析检测。QuEChERS方法最先于2003年应用于水果和蔬菜中的农药多残留检测[20]，是近年发展起来的用于真菌毒素检测的分散固相萃取方法，其利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用达到净化除杂的目的[21-22]。相较于其他净化方法，QuEChERS方法具有操作简单、快速便捷、经济耐用等优点。

本文参考以分散固相萃取用于稻谷中多种真菌毒素分析的研究，采用QuEChERS方法[23]、Agilent QuEChERS dSPE EMR-lipid方法[24]以及Waters DisQuE方法[21]，考察了不同分散固相萃取方法对8种真菌毒素的回收率；以提取后添加法[25-26]考察了大米基质中各目标化合物LC-MS/MS分析的基质效应。优化LC-MS/MS分析参数以提高灵敏度，选择动态多反应监测(Dynamic MRM)采集模式，一次进样即可完成8种真菌毒素的定性定量分析。该方法简便快速，可操作性强，免去了繁琐的固相萃取柱净化步骤，并降低了免疫亲和柱检测成本，为企业及食品安全监管部门提供了有效的技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Survryor系列液相色谱仪(美国ThermoFisher公司)，TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI,美国ThermoFisher公司)，高速匀浆机(德国IKA公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯,美国Tedia公司);实验用水为Milli-Q高纯水；黄曲霉毒素B1(AFB1,2.01 μg/mL)、赭曲霉毒素 A(OTA,10.34 μg/mL)、HT-2毒素(HT-2,100.7 μg/mL)、T-2毒素(T-2,100.6 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(ZEN,100.1 μg/mL)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON,100.3 μg/mL)、伏马毒素B1(FB1,50.9 μg/mL)、伏马毒素B2(FB2,50.1 μg/mL)标准品均购于Romer公司。EMR材料(美国Agilent公司)，DisQuE材料(美国Waters公司)。

1.3 工作溶液的配制

混合标准工作溶液：分别取适量的各单标储备液，配成含0.5 mg/L AFB1，OTA；2.5 mg/L T-2，HT-2，ZEN；25 mg/L FB1，FB2；以及10 mg/L DON的混合标准工作溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，转移并密封于棕色玻璃瓶中，于-20 ℃下避光保存。使用时以乙腈逐级稀释成所需浓度的工作溶液。

1.4 样品前处理方法

1.4.1 QuEChERS方法称取5.0 g样品于250 mL聚乙烯离心管中，加入20 mL水浸泡30 min，再加入25 mL乙腈，匀浆提取后，分别加入10 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，匀浆并离心(5 000 r/min,5 min)。取上层乙腈相4 mL于预先加有1.2 g MgSO4，0.1 g PSA和0.1 g C18的离心管中，涡旋振荡，离心(5 000 r/min,1 min)后，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，滤液待测[23]。

1.4.2 EMR-lipid方法称取5.0 g样品于50 mL聚乙烯离心管中，分别加入含0.1%甲酸的乙腈-水(80∶20)提取液10 mL、含0.1%甲酸的乙腈-水(20∶80)提取液10 mL，超声提取30 min，离心(5 000 r/min,5 min)，合并上清液，再加入1 g柠檬酸钠、1 g氯化钠、4 g硫酸镁和0.5 g柠檬酸氢钠，涡旋振荡并离心(5 000 r/min,5 min)。于EMR-lipid萃取管(dSPE 1010)中加入5 mL水，涡旋振荡后，再加入5 mL上清液，涡旋振荡并离心(5 000 r/min,5 min)，将全部上清液转移至EMR-lipid净化管(Polish 0101)，涡旋振荡并离心(5 000 r/min,5 min)后，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，滤液待测[24]。

1.4.3 DisQuE方法称取5.0 g样品于50 mL聚乙烯离心管中，分别加入10 mL超纯水、10 mL甲酸-乙腈(10∶90)提取液，超声提取30 min，加入1 g柠檬酸钠、1 g氯化钠、4 g硫酸镁和0.5 g柠檬酸氢钠，涡旋振荡并离心(5 000 r/min,5 min)。取5 mL上清液于DisQuE萃取管中(含750 mg硫酸镁、250 mg PSA、150 mg C18和150 mg Al-N)，涡旋振荡并离心(5 000 r/min,5 min)，取上清液0.1 mL，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，混匀后过0.22 μm有机相滤膜，滤液待测[21]。

1.5 色谱-质谱条件

1.5.1 色谱条件色谱柱：XSELECTTMHSS T-3柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温：30 ℃；进样体积：2.0 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；流速：200 μL/min；梯度洗脱条件：0～15.0 min，40%～100% B；15.0～20.0 min，100% B；20.0～20.1 min，100%～40% B；20.1～28.0min，40% B。

1.5.2 质谱条件电喷雾(ESI)正、负离子切换模式采集，其中DON，AFB1，OTA，HT-2，T-2，FB1和FB2采用正离子模式，ZEN采用负离子模式。正、负喷雾电压分别为3 kV和-2.2 kV；离子源温度为350 ℃；鞘气压力为241 kPa；辅助气流量为1.5 mL/min；碰撞气(Ar)压力为0.2 Pa；离子传输管温度为350 ℃；检测方式：选择反应监测(SRM)。其他质谱参数见表1。

表1 分析物的质谱采集离子信息

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS分析参数的优化

采用蠕动泵注射方式，分别对8种目标化合物标准品溶液进样，通过母离子扫描发现，除玉米赤霉烯酮(ZEN)外，所有目标物在正离子模式下均比负离子模式具有更高的响应，且均为[M+H]+准分子离子峰。而ZEN在负离子模式下获得最佳灵敏度，形成[M-H]-峰。通过二级质谱优化，得到8种真菌毒素的最佳MRM采集参数(如表1)。

分别以乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相，分别考察了8种化合物的分离度、峰形及响应值。试验结果表明采用甲醇-水溶液作为流动相时绝大多数目标化合物具有较高的灵敏度，而向水相中添加0.1%甲酸后，各物质的响应值均有一定程度的提升，且OTA和HT-2毒素可获得最佳的灵敏度，离子化效率明显提高。因此选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为最优的流动相。

图1 3 种QuEChERS样品前处理方法应用于毒素添加水平为10～500 μg/kg大米样品的回收率比较Fig.1 Comparison of recoveries of three versions of QuEChERS sample preparation method for rice samples spiked with 10-500 μg/kg toxins

2.2 样品前处理方法的选择

考察了3种QuEChERS样品前处理方法对8种真菌毒素的提取回收率，以大米为基质，在添加水平(10 μg/kg:AFB1,OTA;100 μg/kg:HT-2,T-2,ZEN;250 μg/kg:FB1,FB2;500 μg/kg:DON)下，分别采用QuEChERS方法、EMR-lipid方法和DisQuE方法进行提取。由图1可以看出，当以乙腈-水体系(QuEChERS方法)对8种真菌毒素提取时，FB1，FB2和OTA的回收率均小于10%，其他5种真菌毒素的回收率为95%～116%，因此QuEChERS方法适用于DON，AFB1，HT-2，T-2和ZEN的测定。而当提取溶剂为甲酸-乙腈共萃取剂(EMR方法提取液中含0.1%甲酸,DisQuE方法中含10%甲酸)时，能够兼顾FB1，FB2和OTA的提取效果。这与已有报道基本一致[21,27]，由于多数真菌毒素偏酸性[1]，特别是OTA(苯基丙氨酸部分的pKa=4.4)对提取液pH值较为敏感，而甲酸-乙腈的酸性环境可抑制真菌毒素的电离，使得目标化合物在乙腈中的分配系数增加，从而提高了提取效率。EMR-lipid方法测得AFB1和HT-2的回收率小于60%，但EMR-lipid方法能够同时满足FB1，FB2，T-2，ZEN和OTA的测定，回收率均大于85%。而DisQuE方法能够兼顾8种真菌毒素的提取效果，回收率均大于72%。

基质效应(Matrix effect,ME)是影响LC-MS/MS定量分析准确性的重要因素。实验采用基质效应强弱来进一步评价DisQuE方法和EMR-lipid方法的纯化效果[25]。分别以两种方法处理得到的样品粗提液、样品纯化后溶液和0.1% 甲酸水溶液配制8种真菌毒素的混合标准溶液。各目标化合物的质量浓度范围为：AFB1，OTA：0.2～25.0 μg/L；HT-2，T-2，ZEN：5.0～250.0 μg/L；FB1，FB2：10.0～500.0 μg/L；DON：20.0～1 000.0 μg/L。经LC-MS/MS测定，以目标化合物定量离子的峰面积(y)对含量(x,μg/L)绘制标准曲线。以前两组样品获得的曲线斜率与后一组样品获得的曲线斜率比值(η)来判定基质效应的强弱[28]。η值越接近1，基质效应越弱；η值偏离1越大，基质效应越强。结果表明，与DisQuE方法相比，EMR-lipid方法的基质效应较强(如图2)。当样品经EMR-lipid方法净化后，ZEN和OTA均表现出较强的基质效应，ZEN的η值为1.80，而OTA的η值高达2.36。而当样品经DisQuE方法净化后，各目标化合物的基质效应明显减弱，其η值在1.00～1.16之间。由于两种方法的稀释倍数不同，因此比较了在稀释倍数相同的情况下DisQuE方法和EMR-lipid方法的基质效应。结果表明，即使在稀释相同倍数的条件下，EMR-lipid方法仍具有较强的基质效应，其η值介于0.92～2.31之间。这可能是由于DisQuE方法采用C18和Al-N作为吸附剂，C18可有效去除基质中的脂类、糖类等亲脂型杂质，Al-N则通过与基质中含有N，O，P，S等化合物形成金属簇来有效地除去极性杂质[21]。而EMR-lipid方法只能去除亲脂类等杂质[24]。

由此可见，DisQuE方法具有较好的纯化效果，提高了方法的准确度。因此最终选择DisQuE方法作为本实验的样品前处理方法。

2.3 方法学验证

用0.1%的甲酸水溶液配制一系列浓度的标准溶液，在优化条件下进行测定，分别以各分析物定量离子的峰面积对质量浓度(μg/L)绘制标准曲线。各化合物的线性范围如表2所示，其相关系数均大于0.995 7。

表2 方法的灵敏度、相关系数(r)及回收率(n=6)

*y:peak area;x:mass concentration of analyte,μg/L

采用外标法定量，应用“1.4.3”的DisQuE样品前处理方法，在大米空白基质(安徽省小楼村) 中添加低、中、高3个浓度水平的标准溶液进行加标回收实验，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD,n=6)。在大米样品中添加不同浓度的待测物，按本方法进行检测，以S/N=3确定各目标化合物的检出限(LOD)，以S/N=10确定各目标化合物的定量下限(LOQ)。结果表明，目标分析物的平均加标回收率为70.0%～124.1%，RSD为0.9%～16.9%；8种目标物的LOD为1.2～60.0 μg/kg，LOQ为4.0～200.0 μg/kg(表2)，方法的灵敏度完全满足国家标准对真菌毒素的限量检测要求[18,29]。图3为空白大米加标回收的定量离子色谱图。

图3 空白大米加标回收的定量离子色谱图

2.4 实际样品检测

利用本方法，对农贸市场采购的20份大米样品进行测定。结果表明，大米样品中均不同程度地检出FB1和FB2，其余真菌毒素均未检出。FB1,FB2在大米样品中的提取离子色谱图见图4。

3 结 论

本文建立了一种基于分散固相萃取原理的DisQuE前处理技术，结合液相色谱-串联质谱快速测定大米中黄曲霉毒素B1等8种真菌毒素的方法。通过比较QuEChERS，EMR-lipid以及DisQuE 3种不同前处理方法净化后目标物的提取效率及基质效应，验证了DisQuE提取方法的有效性。通过优化液相色谱与质谱的采集参数，得到了最佳的仪器检测条件。方法学考察及实际样品的检测证明，该方法实用、可靠，具有简单、经济、快速、准确等优点，可作为大米中真菌毒素的快速检测方法。

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Determination of Eight Mycotoxins in Rice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Wei-hua,YANG Huan,CAO Zhao-yun,MA You-ning,QIN Mei-ling,CHAI Shuang-shuang,CHEN Ming-xue*

(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center of Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China)

A rapid method was developed for the determination of HT-2 toxin,T-2 toxin,fumonisin B1,fumonisin B2,zearalenone,ochratoxin A,deoxynivalenol and aflatoxins B1 in rice.Three dispersive solid phase extraction sample preparation methods,including QuEChERS method,EMR-lipid method and DisQuE method,were compared for the determination of 8 mycotoxins in rice.The recoveries of the three extraction methods for the toxins were studied.The method of after-extraction addition was used to evaluate the matrix effects for mycotoxins in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).As a result,the QuEChERS method was not suitable for the analysis of fumonisin B1,fumonisin B2 and ochratoxin A.The EMR-lipid methods could not overcome the matrix effects of zearalenone and ochratoxin A in rice.In this study,mycotoxins were extracted by DisQuE method,and analysed by LC-MS/MS under the optimized condition with monitoring 16 pairs of MS/MS transitions of precursor ions(two for each mycotoxin) in one single run.Recoveries at three fortified levels in rice ranged from 70.0% to 124.1% with relative standard deviations of 0.9%-16.9%.The limits of detection(S/N≥3) were in the range of 1.2-60.0 μg/kg.The method was proved to be highly efficient,robust and sensitive,and was suitable for the simultaneous analysis of mycotoxins in rice.

QuEChERS method;EMR-lipid method;DisQuE method;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);mycotoxins;rice

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.008

2016-07-03；

2016-08-04

国家农产品质量安全风险评估项目(GJFP2016001001);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014RG006)

*通讯作者：陈铭学，研究员，研究方向：农产品质量安全风险评估技术，Tel:0571-63370275，E-mail:cmingxue@163.com

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)01-0047-07