周 蓉，曹赵云，赵肖华，林晓燕，牟仁祥

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)

分散固相萃取-分散液液微萃取/气相色谱-串联质谱法测定蔬菜中19种有机磷农药残留

周 蓉，曹赵云，赵肖华，林晓燕，牟仁祥*

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)

采用分散固相萃取和分散液液微萃取联用方法，建立了气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS) 同时测定蔬菜中19种有机磷农药残留量的分析方法。分散固相萃取方法以乙腈为萃取液，以N-丙基-乙二胺(PSA) 和C18为吸附剂。对影响分散液液微萃取效率的因素(萃取溶剂种类及体积、分散剂体积等) 进行优化，同时分析了实验过程中添加掩蔽试剂L-古洛糖酸γ-内酯(AP)对基质效应补偿作用的影响。在最佳实验条件下，19种有机磷在辣椒和大葱中3个添加水平(0.05,0.1,0.5 mg/kg)的回收率为76.9%～126.8%，相对标准偏差为0.6%～7.3%，检出限(S/N=3)为0.10～0.50 μg/kg。该方法简单、高效、重现性好、富集倍数高，可用于蔬菜中有机磷农药的快速检测。

分散液液微萃取；分散固相萃取；气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)；有机磷；蔬菜

农药残留检测技术是国内外农产品质量安全领域的一个重要关注点。而随着测定对象越来越复杂，待测组分的含量越来越低，有关高灵敏度、高选择性、简便、经济实用的分析方法的研究日益受到重视。近年来，随着质谱联用技术在制定标准中的加大应用，其在多组分农药分析方面的分离和确证的优势也愈加突出[1-3]]，但在一些葱、姜、韭菜等复杂基质样品的分析实践中，由于存在基质效应及其它干扰而难以得到准确的测定结果。因此，样品前处理是复杂样品分析中不可或缺的重要步骤，是制约高灵敏度、高选择性分析方法发展的瓶颈之一[4]。

目前，关于有机磷农药的残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[5-10]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[11-13]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[14-16]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[17-20]。GC-MS/MS是高灵敏度和普适性较好的监测方法，应用于有机磷的残留分析可取得较好效果。由于样品基质的复杂性和有机磷农药在环境中的残留量相对较低，为了得到较为准确的检测结果，样品的前处理和富集过程成为关键环节。目前，常用的前处理提取净化方法有液-液萃取(LLE)[4]、超临界流体萃取(SFE)[21]、微波辅助提取(MAE)[22]、固相萃取(SPE)[23-24]和固相微萃取(SPME)[7]等。分散固相萃取技术(DSPE)目前在果蔬的农药残留检测中得到广泛应用[18,20,25]，但由于该方法为净化方法，不包含富集步骤，因此富集倍数低、灵敏度不够高是亟待克服的缺陷。分散液液微萃取(DLLME)是在均相液液微萃取和浊点萃取(CPE)的基础上形成的一种简单、快速的微萃取技术[7,26]，该方法集萃取与富集于一体，有机溶剂用量少，萃取时间短，具有很高的萃取效率和富集倍数。DSPE和DLLME联用技术具有溶剂用量少、分析时间短、富集倍数高等优点，且此联用技术用于蔬菜中有机磷的残留检测少有报道。

常规的DLLME技术多采用密度比水大的有机溶剂(如氯苯、四氯化碳、四氯乙烯等)，但这些含有卤素的溶剂毒性高，且对电子捕获检测器的影响大，影响待测物的灵敏度，干扰有机磷测定。本文利用分散固相萃取技术(DSPE)和分散液液微萃取技术(DLLME)相结合的样品提取方法，采用密度比水小的环己烷溶剂作为萃取剂，同时加入掩蔽试剂L-古洛糖酸γ-内酯(AP)，消除基质效应，从而建立一种高效快速的气相色谱-串联质谱分析方法。该方法检测速度快、富集倍数高、检出限低，实现了从复杂基质中选择性测定某些待测物的目标，可满足国际上日益严格的农药残留限量的检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

7890A-7000A气相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有EI源(美国Agilent公司)；高速分散机、旋涡振荡仪(德国 IKA公司)；台式高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司)。乙腈(农残级，美国Tedia公司)；硫酸镁(纯度大于97%，比利时ACROS公司)；氯化钠(农残级，德国CNW公司);N-丙基乙二胺(PSA)和三官能十八烷基/硅胶基体(C18,粒径40 μm，美国Aglient公司)；甲苯、二甲苯、正己烷和环己烷(农残级，美国Tedia公司)；实验用水为Milli-Q高纯水。基体改进剂：AP(纯度大于97%，比利时ACROS公司)；掩蔽试剂溶液(10 g/L):称取 AP改进剂100 mg于10 mL容量瓶中，加入2 mL水使之溶解，然后用乙腈定容至10 mL，混匀，过0.22 μm有机滤膜，备用。

农药标准品(1 000 mg/L，购自农业部天津环境保护研究所)；农药标准品用丙酮-甲苯(3∶7，体积比)配成20 mg/L的混合标准储备液；将混合标准储备液用乙腈逐级稀释成浓度为2.5 mg/L及0.1 mg/L的标准工作溶液，测定前将0.1 mg/L的上机工作液，按标准上机工作溶液与掩蔽试剂的体积比10∶1加入掩蔽试剂，混匀。

1.2 样品前处理

样品提取：称取25.0 g粉碎均匀的蔬菜试样(精确至0.1 g)于250 mL离心管中，加入25 mL乙腈，在高速分散机中高速匀浆2 min，加入10.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，在低速分散机中低速匀浆1 min，2 500 r/min离心3 min，使乙腈和水相分层。

样品净化：移取4 mL上层乙腈溶液于15 mL刻度离心管中，离心管中预先加入100 mg PSA，100 mg C18和1 200 mg无水硫酸镁，涡旋混合1 min后，以8 000 r/min离心5 min。取上清液1 mL至10 mL离心管中，加入200 μL环己烷萃取剂，轻轻振荡混匀，使萃取剂均匀地分散在样品溶液中，然后加入5 mL水，涡旋振荡1 min，形成均匀的乳浊液，于 8 000 r/min离心5 min使之分层，吸取环己烷上清液100 μL于进样瓶的内插管中，并加入 10 μL掩蔽试剂AP，摇匀，待测。

1.3 共提取基质干扰物的净化效果比较

样品按“1.2”方法进行均质提取，各取10 mL提取液分别采用以下3种吸附剂进行分散固相萃取净化：①C18(500 mg)，②C18/PSA(250 mg/250 mg)，③PSA(500 mg)；涡旋振荡1 min，于8 000 r/min离心5 min，3种净化液与未净化液各取5 mL于烘干的蒸发皿中挥干，然后于100 ℃烘干1 h后冷却称重，计算各提取液净化前后的蒸发残渣质量。

表1 19种有机磷农药的保留时间及在多反应监测模式下的定性离子和定量离子

表2 19种农药(0.1 mg/kg)经过不同吸附剂净化后的回收率(n=6)

1.4 GC-MS/MS条件

色谱条件：HP-5MS色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气氦气；升温程序：70 ℃ 保持2 min，以15 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；后运行：300 ℃，2 psi，5 min；进样量：1 μL；进样方式：分流进样，分流比为5∶1；进样口温度250 ℃，压力32 psi；隔垫吹扫流速：3 mL/min；反吹系统：限流器Agilent RS001(0.6 m×150 μm)，初始温度：70 ℃，压力4 psi，后运行：300 ℃，60 psi，5 min。

质谱条件：碰撞气流速2.25 mL/min；猝灭气流速1.5 mL/min；电子轰击源(EI)，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；GC-QQQ连接口温度280 ℃。其他条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 DSPE净化条件的优化

以韭菜样品提取液的净化效率和19种有机磷农药的加标回收率为主要指标，比较了PSA,C18吸附剂以及两者结合使用对蔬菜样品基质的净化效果和对19种农药的吸附情况。

按照“1.3”方法进行试验，按下式计算净化效率：(提取液蒸发残渣质量/提取液相当的样品质量)×100%，结果显示PSA能有效去除蔬菜中的有机酸等极性杂质，但对色素的吸附能力较弱，净化效率为52%；C18对色素的吸附效果好，但色谱杂质峰较PSA多，净化效率为56%；两者结合使用可提高其净化效率，蔬菜基质的净化效率达71%。

以蔬菜样品中的加标回收率为指标，进一步考察了PSA，C18吸附剂以及两者结合使用对19种农药的吸附情况。表2为19种有机磷农药在0.1 mg/kg添加浓度下，分别用200 mg的PSA，200 mg C18以及各100 mg两者的混合物进行净化得到的回收率数据。结果发现两种吸附剂混合后得到的回收率最好，达74.1%～98.2%。

2.2 DLLME方法的优化

2.2.1 萃取剂及其体积的优化传统的DLLME操作中多使用含卤素的化合物如氯苯、二氯苯、四氯乙烯等密度比水大的试剂作为萃取溶液，但这些溶剂对电子捕获检测器的影响大，且溶剂干扰杂质多。本实验以1 mL乙腈为分散剂，选择甲苯、二甲苯、正己烷和环己烷4种密度比水小的有机溶剂作为萃取溶剂。结果显示，当以甲苯和二甲苯为萃取剂时，敌敌畏、水胺硫磷的萃取效率分别为49.3%和51.4%，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果和乐果的萃取效率只有29.7%～35.4%。以正己烷作为萃取剂时，水胺硫磷和亚胺硫磷的萃取效率也分别只有50.7%和56.4%，其它有机磷农药的萃取效率为65%～85%。而以环己烷作为萃取剂时，19种有机磷的萃取效率可达78%～110%，萃取效果较满意。因此实验选择环己烷作为最佳萃取溶剂。

萃取体积也会影响萃取效率。实验以1 mL的乙腈为分散剂，分别使用不同体积(50，100，150，200，300 μL)环己烷作为萃取溶剂进行萃取实验，发现当环己烷体积为50，100 μL时，因其体积很小，较难吸取，离心效果不好；环己烷体积为200 μL时，回收率可达80.6%～108.6%，萃取效果较理想；当环己烷体积达到300 μL时，由于浓缩倍数不高，影响检出限和回收率。故选择环己烷的体积为200 μL。

2.2.2 分散剂体积的选择分散剂乙腈的体积会影响环己烷在水中的分散程度，进而影响萃取效率。实验分别考察了乙腈体积在700～1 500 μL范围内对萃取效率的影响。随着乙腈体积的增大，大部分有机磷农药的萃取效率先升高后降低，在1 000 μL时达到最大值(77%～109.3%)，随后呈下降趋势。这是由于乙腈体积较小时，环己烷未能均匀分散在水中，导致萃取效率低；当体积过大时，使得待测物在水中的溶解度增大，萃取效率降低，故选取分散剂的体积为1 000 μL。

2.3 基质效应

气相色谱-质谱联用分析中常存在基质效应。L-古洛糖酸γ-内酯(AP)是一类含有多羟基基团的化合物，能阻止活性位点与待测物之间的相互作用，具有良好的补偿作用。实验分别以乙腈和空白韭菜基质溶液作为溶剂，配制0.1 mg/kg的溶剂标准溶液和基质标准溶液，同时对加入掩蔽试剂AP进行研究。基体改进剂对甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、水胺硫磷、三唑磷等农药基质效应的补偿作用尤为明显。在不添加AP的溶剂(乙腈)标准溶液中，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果表现为不出峰，而对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、亚胺硫磷等农药则峰形差、响应低，19种有机磷农药的回收率是溶剂标准溶液添加AP时的0%～61.4%。而基质配标中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果和甲基对硫磷等基质敏感农药的回收率只有添加AP的50%左右，添加AP后19种有机磷农药的回收率为79.7%～112.8%。可见掩蔽试剂AP的加入能够明显改善上述较为敏感农药的色谱行为，使其响应值明显增大，峰形改善，特别是对易被衬管和进样口吸附的极性农药(如甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果和乐果等)起到了很好的保护作用，与林晓燕等[16]的报道一致。同时，实验发现标样加入AP后，各农药的响应值与基质配标中各农药的响应值相当。因此，加入掩蔽试剂AP能够实现对敏感农药的基质补偿和保持非敏感农药良好响应值的效果。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围与检出限准确配制一系列质量浓度(0.5，1.0，1.5，5.0，10，50，100 μg/kg)的混合有机磷标准溶液，按“1.2”条件进行测定，并以分析物的峰面积(Y)对各农药的含量(X，μg/kg)作标准曲线，结果见表3。19种农药在0.5～100 μg/kg范围内均具有良好的线性关系。检出限(LOD，S/N≥3)为0.10～0.50 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N≥10)为0.3～1.5 μg/kg，可满足实际样品测定的需要。

表3 19种有机磷农药的线性方程、相关系数(r2)、线性范围、检出限及定量下限

(续表3)

图1 19种有机磷标准溶液(0.1 mg/kg)的选择离子监测总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of nineteen organophosphorus pesticides(0.1 mg/kg) standard solution in SIM mode

图2 实际样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of a real sample

2.4.2 方法的准确度与精密度采用基质匹配标准溶液-外标法定量，分别在辣椒、大葱2种比较复杂的空白基质中添加19种有机磷农药进行回收率试验，添加水平为0.05，0.1，0.5 mg/kg，每个水平重复测定6次，按优化的方法测定19种有机磷的含量，方法的回收率结果见表4。19种有机磷的回收率为76.9%～126.8%，相对标准偏差(RSD)为0.6%～7.3%。本方法的回收率和精密度均符合残留分析要求。19种有机磷农药标准溶液在SIM模式下的总离子流图见图1。

2.5 实际蔬菜样品的分析

利用建立的方法，对随机抽样于各农贸市场、基地的蔬菜样品进行检测。结果显示，其中1份青菜样品检出毒死蜱，其检出量为0.029 2 mg/kg。其它有机磷农药均未检出，检出样品的图谱见图2。

表4 19种有机磷农药在辣椒和大葱基质的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

(续表4)

3 结 论

本文成功地将分散固相萃取净化技术与分散液液微萃取技术相结合，应用于蔬菜中的有机磷农药残留分析，建立了其与气相色谱-串联质谱联用的新方法，并将其用于19种有机磷农药的测定。该方法较好地降低了样品基质的干扰，实现了从复杂基质中选择性测定某些待测物的目标。与传统的样品前处理方法相比，本方法具有简单易操作、分离效果好、有机溶剂消耗少等特点，多数样品获得了较高的回收率和较好的净化富集以及基质补偿效果。通过进一步的拓展研究，该方法可用于农产品中有机磷等农药的安全监测分析，是一种简捷、高效和准确的检测方法。

[1] Xu X L,Zhao H X,Li L,Liu H X,Ren H L,Zhong W K.Chin.J.Chromatogr.(许秀丽，赵海香，李礼，刘汉霞，任荷玲，仲维科.色谱)，2012,30(3):267-272.

[2] Anastassiades M,Maštovská K,Lehotay S J.J.Chromatogr.A,2003,1015:163-184.

[3] Erney D R.J.HighResol.Chromatogr.,1993,16:501-503.

[4] Yan K L,Lin L Q,Zheng X X,Xiao X H,Cao Y J.Chin.J.Chromatogr.(严矿林，林丽琼，郑夏汐，肖小华，曹玉娟.色谱)，2013，31(7):634-639.

[5] Ahmadi F,Assadi Y,Hosseini S M,Rezaee M.J.Chromatogr.A,2006,1101:307-312.

[6] Berijani S,Assadi Y,Anbia M,Hosseini M M,Aghaee E.J.Chromatogr.A,2006,1123:1-9.

[7] Samadi S,Sereshti H,Assadi Y.J.Chromatogr.A,2012,1219:61-65.

[9] Fan Y G,Liao J,Liang J,Mo L X,Wang T S,Ya Y,Liang Q,Li S.PlantDiseasesandPests,2013,4(4):8-11.[10] Pu J Q,Tang Y P,Tang H Y,Qi L F.YunnanAgric.Sci.Technol.(普继琼，汤燕萍，唐海彦，期丽芬.云南农业科技)，2013,4:23-25.

[11] Salvador M,Frenich A G,González F E,Vidal J M.Chromatographia,2006,64:667-672.

[12] Li Y X,Huang Y,Li F S,Fang Q M,Wang Y M,Ming J J.Chin.J.HealthLab.Technol.(李永香，黄勇，李发生，房其美，王玉红，明佳佳.中国卫生检验杂志)，2004,14(6):677-679.

[13] Shuai Q,Yang W,Zheng Y J,Zheng C G.Chin.J.Chromatogr.(帅琴，杨薇，郑岳君，郑楚光.色谱)，2003,21(3):273-276.

[14] Leandro C C,Fussell R J,Keely B J.J.Chromatogr.A,2005,1085:207-212.

[15] Hu M H,Zhu H F,Ma L F.J.Instrum.Anal.(胡美华，朱惠芳，马丽芳.分析测试学报)，2016,35(5):569-573.[16] Lin X Y,Cao Z Y,Mou R X,Wu L,Zhu Z W,Chen M X.J.Agro-Environ.Sci.(林晓燕，曹赵云，牟仁祥，吴莉，朱智伟，陈铭学.农业环境科学学报)，2015,34(12):2439-2448.

[17] Li C X,Zhao X L,Gao L H,Shi Y L,Tan W Q,Cai Y Q.J.Instrum.Anal.(李闯修，赵晓丽，高丽红，史亚利，谭伟强，蔡亚岐.分析测试学报)，2016,35(2):194-199.

[18] Leandro C C,Hancock P,Fussell R J,Keely B J.J.Chromatogr.A,2007,1144:161-169.

[19] Wang L Z,Zhou Y,Chen Y,Wang R L,Lin Z X,Lin D J,Zheng S H.Chin.J.Chromatogr.(王连珠，周昱，陈泳，王瑞龙，林子旭，林德娟，郑少惠.色谱)，2012,30(2):146-153.

[20] Ye R H,Su J F.Chin.J.Chromatogr.(叶瑞洪，苏建峰.色谱)，2011,29(7):618-623.

[21] Chikushi H,Fujii Y,Toda K.J.Chromatogr.A,2012,1256:267-270.

[22] Azzouz A,Ballesteros E.Sci.TotalEnviron.,2012,419:208-215.

[23] Aguilar C,Ferrer I,Borrull F,Barceló D.Anal.Chim.Acta,1999,386:237-248.

[24] Poole C F,Gunatilleka A D,Sethuraman R.J.Chromatogr.A,2000,885:17-39.

[25] Xia Y,Zhang L,Zhao E C,Jia C H,Zhu X D.J.Instrum.Anal.(夏英，张澜，赵尔成，贾春虹，朱晓丹.分析测试学报)，2014,33(2):192-196.

[26] Rezaee M,Yamini Y,Faraji M.J.Chromatogr.A,2010,1217:2342-2357.

Determination of Nineteen Organophosphorus Pesticides in Vegetables by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Combined with Dispersive Solid-phase Extraction and Dispersive Liquid-Liquid Micro-extraction

ZHOU Rong,CAO Zhao-yun,ZHAO Xiao-hua,LIN Xiao-yan,MOU Ren-xiang*

(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center,Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China)

A gas chromatograpy-tandem mass spectrometric(GC-MS/MS) method for the determination of nineteen organophosphorus pesticides in vegetables was developed using dispersive solid-phase extraction(DSPE) and dispersive liquid-liquid micro-extraction(DLLME) as sample preparation methods.With dispersive solid-phase extraction,PSA and C18were used as the sorbents,and acetonitrile as the eluted solvent.Some experimental parameters influencing the extraction efficiency,such as the types and volume of the dispersive solvents and extraction solvents were examined and optimized.Gamma-L-gulonic acid lactone(AP) used as a masking regent for compensation effect of matrix was evaluated.Under the optimum conditions,the recoveries of nineteen organophosphorus pesticides in pepper chili and shallot samples at fortified levels of 0.05,0.1,0.5 mg/kg ranged from 76.9%to 126.8%with relative standard deviations of 0.6%-7.3%.The limits of detection(S/N=3) were in the range of 0.10-0.50 μg/kg.With the advantages of quickness,low toxicity and high enrichment factors,the proposed method is applicable for the analysis of organophosphorus pesticides in vegetables.

dispersive liquid-liquid micro-extraction;dispersive solid-phase extraction;gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS);organophosphorus pesticides;vegetables

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.011

2016-08-10；

2016-09-20

浙江省科技计划项目(2015C37057)

*通讯作者：牟仁祥，副研究员，研究方向：农产品标准与检测技术，Tel：0571-63370275，E-mail：mourx@hz.cn

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2017)01-0067-06