冯 皓, 祝一鸣, 王 伟, 刘 易, 贺 佳, 王 军, 单体江

(华南农业大学林学与风景园林学院,广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,广州 510642)

黄金香柳挥发油化学成分分析及其抗细菌活性

冯 皓, 祝一鸣, 王 伟, 刘 易, 贺 佳, 王 军, 单体江*

(华南农业大学林学与风景园林学院,广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,广州 510642)

采用水蒸气蒸馏法提取黄金香柳枝叶中的挥发油,得率为0.972% (以鲜重为基础)。通过GC-MS分析,从黄金香柳枝叶中共鉴定出18种成分,占总相对含量的99.056%,其中主要成分是甲基丁香酚(92.185%)和肉桂酸甲酯(3.795%)。黄金香柳枝叶挥发油对6种供试细菌表现出一定的抑菌作用,其中对黄瓜角斑病菌和根癌农杆菌的抑菌活性最好,抑菌圈直径分别为(9.0±0.0)mm和(8.5±0.1)mm,但仍弱于阳性对照硫酸链霉素对黄瓜角斑病菌(18.0±1.0)mm和根癌农杆菌(21.7±1.0)mm的活性。

黄金香柳; 挥发油; 化学成分分析; 抗细菌活性

黄金香柳Melaleucabracteata,又名千层金、黄金宝树、黄金串钱柳,属于桃金娘科白千层属常绿小乔木或灌木[1-2]。原产于新西兰、澳大利亚,20世纪90年代首次作为彩叶树种从澳洲引种到我国[3]。黄金香柳树体金黄,株形通直,适生范围广,不仅生长快,耐修剪,更具有强大的抗病虫、抗旱、耐涝及抗风特性,是现今世界上最流行、最具观赏价值的色叶乔木新树种之一。黄金香柳不仅能用于庭园景观绿化,亦可用于林相改造[2],其大面积的推广和种植对于丰富华南地区城市绿化树种和提高城市景观多样性具有重要意义。

黄金香柳枝叶芳香宜人,目前关于其研究多集中于黄金香柳挥发油化学成分及其提取方法等方面[2, 4],黄金香柳芳香油是目前世界上珍贵的化妆品香料之一,且具有很强的杀螨活性和驱虫性[5],然而对于其挥发油抗细菌活性以及在农林业上的应用却鲜有报道。本研究采用水蒸气蒸馏法提取黄金香柳的挥发油,通过GC-MS分析鉴定其主要成分,并通过滤纸片扩散法测定了黄金香柳挥发油对6种供试细菌的抑菌活性,以期为黄金香柳推广和种植以及挥发油在农林病害生物防治上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

黄金香柳枝叶于2015年7月23日采自华南农业大学校园,标本由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师鉴定。

1.2 仪器与试剂

主要仪器: 水蒸气蒸馏装置(北京永光明医疗仪器厂);6890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(Agilent Technologies,USA);主要试剂: 正构烷烃C8～C40(美国Sigma公司);硫酸链霉素(美国Sigma公司);氯化钠、无水乙醚、无水硫酸钠等均为国产分析纯(北京化学试剂公司)。

1.3 黄金香柳挥发油的提取

参照Lou等[6]的方法。采集黄金香柳枝叶,称重后将其装入水蒸气蒸馏装置内,加入适量蒸馏水,待温度升至100℃,有液滴滴下时开始计时,连续蒸馏6 h,收集蒸出的挥发油,加入一定量的NaCl,用无水乙醚连续萃取3次,合并萃取液,加入无水硫酸钠进行干燥,浓缩萃取液或让无水乙醚自然挥发,待挥发干后计算得率,4℃密封保存,备用。

1.4 黄金香柳挥发油化学组分的GC-MS分析

黄金香柳挥发油化学组分的鉴定在6890N-5975C GC-MS上进行,色谱柱为DB-5(30 m×250 μm×0.25 μm),无分流进样,进样量1 μL。升温程序:进样口温度230℃,起始温度70℃,保持1 min,以8℃/min上升到120℃,保持1 min,以30℃/min上升到150℃,保持1 min,以5℃/min上升到175℃,保持0 min,再以1℃/min上升到180℃,保持0 min,最后以5℃/min上升到240℃,保持0 min。离子源温度230℃,电离方式为EI,电离能量70 eV,载气为He,流速1 mL/min,全扫描采集,质谱检测器(MSD)检测。通过与标准化合物的保留时间和质谱图作对比,确定待测成分。

保留系数(retention index,RI)的测定[7-8]:系列正构烷烃C8～C40用氯仿稀释50倍,然后与上述GC条件一样进行分离,记录C8～C40各正构烷烃的保留时间。用线性升温公式计算各成分的RI:RI=100n+100(lgtx-lgtn)/(lgtn+1-lgtn),其中tx、tn和tn+1分别为被分析的组分和碳原子数处于n和n+1之间的正烷烃(tn

1.5 黄金香柳挥发油抗菌活性的测定

供试细菌:均为革兰氏阴性菌，包括枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、桉树青枯菌Ralstoniasolanacearum、番茄疮痂病菌Xanthomonasvesicatoria、黄瓜角斑病菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans、大肠杆菌Escherichiacoli和根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens,以上菌株由华南农业大学林学与风景园林学院森保教研室提供。

黄金香柳挥发油抗细菌活性的测定参照赵文越[9]和龚佑文[7]等的方法,略有改进。供试细菌由于长期保存在-20℃下,在活性测定前,先用LB 平板进行活化培养(28℃,暗)48 h,然后挑取单菌落,在LB液体培养基中摇培(28℃,暗,150 r/min)24 h,将菌液浓度稀释到108cfu/mL备用。倒好平板后,用移液枪分别吸取50 μL菌液,用玻璃棒涂板。用镊子夹取直径6 mm的无菌滤纸片放在带菌平板上,每皿放置3片,在滤纸片滴加8 μL的黄金香柳挥发油,每个菌种平行测定3次。阳性对照为8 μL的0.2%硫酸链霉素。然后将平板放在28℃,黑暗条件下培养,24 h后测量抑菌圈直径。采用SAS 8.2软件对数据进行分析,显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 黄金香柳挥发油化学成分分析

采用水蒸气蒸馏法提取黄金香柳枝叶中的挥发油,得率为0.972% (以鲜重为基础)。黄金香柳挥发油总离子流色谱图如图1所示。通过GC-MS分析,各组分峰用NIST Library(2011版)质谱库进行检索,从黄金香柳枝叶中共鉴定出18个成分,占总相对含量的99.056%,采用GC峰面积归一化法定量分析,计算出各成分的相对含量,黄金香柳枝叶挥发油组成成分及其相对含量见表1。从表中可以看出,黄金香柳挥发油主要是萜类化合物及其含氧衍生物,其中主要成分是甲基丁香酚,其相对含量高达92.185%;此外,肉桂酸甲酯的相对含量为3.795%,其余成分的相对含量均在0.4%以下。以上结果表明,黄金香柳枝叶中含有大量的挥发性成分,而挥发性油的成分主要是甲基丁香酚和肉桂酸甲酯,可作为观赏树种种植。

表1 黄金香柳挥发油成分及其含量测定结果

Table 1 Test results of the constituents and contents of volatile oils fromMelaleucabracteata

编号No.保留时间/minRetentiontime保留系数Retentionindex化合物Compound化学式Molecularformula分子量Molecularweight相对含量/%Relativecontent16.17310294-乙基邻二甲苯4-Ethyl-o-xyleneC10H141340.12227.5851085D2-蒈烯D2-CareneC10H161360.16537.8901096α-葑烯α-FencheneC10H161360.315410.4471201茴香脑cis-AnetholC10H12O1480.261511.1471230香茅烯(-)-CitronelleneC10H181380.152613.1901306反式-肉桂酸甲酯(E)-3-PhenylacrylicacidmethylesterC10H10O21620.123714.49713585-丁子香酸5-AllylguaiacolC10H12O21640.178815.3411389肉桂酸甲酯MethylcinnamateC10H10O21623.795915.8751410甲基丁香酚MethyleugenolC11H14O217892.1851016.3031428(Z)-石竹烯(Z)-CaryophylleneC15H242040.1571117.84914901-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthaleneC15H242040.1681218.8061529δ-杜松烯δ-CadineneC15H242040.2761318.9031533l-卡拉烯l-CalameneneC15H222020.2601419.4321554榄香素ElemicinC12H16O32080.2641520.4221592δ-芹子烯δ-SelineneC15H242040.1571621.59316681,2,4a,5,6,8a-Hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthaleneC15H242040.1961722.80717363,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯3,4,5-TrimethoxybenzoicacidmethylesterC11H14O52260.1221829.3542072叶绿醇PhytolC20H40O2960.160

图1 黄金香柳挥发油总离子流色谱图Fig.1 TLC of volatile oils from Melaleuca bracteata

2.2 黄金香柳挥发油的抗细菌活性

黄金香柳挥发油对6种细菌的抑制活性如图2所示,从图中看出,黄金香柳挥发油对6种供试细菌虽然表现出一定的抑菌作用,但抑菌效果不明显;与阳性对照相比,黄金香柳挥发油对6种细菌的抑制活性均弱于硫酸链霉素。黄金香柳挥发油对不同细菌的抑制活性也略有不同,通过SAS分析发现,对黄瓜角斑病菌和根癌农杆菌的抑菌活性最好,抑菌圈直径分别为(9.0±0.0)mm和(8.5±0.1)mm;而对大肠杆菌的抑菌效果最差,几乎无抑制作用;对桉树青枯病菌、番茄疮痂病菌和枯草芽胞杆菌的抑制活性无显著性差异,抑菌圈直径在7.0～7.3 mm之间。

3 讨论

黄金香柳作为园林景观和绿化树种,在我国南方尤其是华南地区种植广泛。钟昌勇等[4]采用水蒸气蒸馏法测得黄金香柳挥发油的得率为1.13%,其中甲基丁香酚的相对含量达到95.45%;叶征美等[2]测得黄金香柳挥发油甲基丁香酚的相对含量为83.55%;秦荣秀等[10]研究发现黄金香柳芳香水和黄金香柳挥发油的主要化学成分基本一致,黄金香柳挥发油的主要成分为甲基丁香酚,含量达90%。本研究的结果表明,黄金香柳挥发油的得率为0.972%,其主要成分甲基丁香酚的相对含量为92.185%,这与前人的研究基本一致,但在化合物的数量以及相对含量上有所差异。一方面与黄金香柳的品种和生长地点等有关,另一方面也与采集时间和提取方式有关。

图2 黄金香柳挥发油的抗细菌活性Fig.2 Antibacterial activity of the volatile oils from Melaleuca bracteata

黄金香柳挥发油对6种供试细菌的生长表现出一定的抑制活性,但抑菌效果不明显,可能与黄金香柳挥发油的主要成分有关,甲基丁香酚广泛存在于多种植物挥发油中,如细辛、肉豆蔻、辣椒、柠檬草、龙蒿、罗勒、八角茴香和茴香等[2],目前尚未见关于甲基丁香酚抑菌作用的研究。但甲基丁香酚作为橘小实蝇的引诱剂对性成熟的雄虫具有强烈的引诱作用,引诱效果明显且持效期长[2, 11-13],在生物防治上具有潜在的利用价值。肉桂酸甲酯又称β-苯基丙烯酸甲酯,具有果香膏香,可作为制造香水香精、皂用香精的定香剂,也可作为食用香精。从黄金香柳枝叶中提取到的肉桂酸甲酯已被广泛应用于香料和防晒护肤品中[14],在食品、日用化妆品、制皂等方面有着广泛的用途[15-16]。黄金香柳作为高产甲基丁香酚和肉桂酸甲酯挥发油的树种具有潜在的研究前景和应用价值,其本身能否作为生防树种应用于园林病虫害的防治还有待于更深入的研究。

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(责任编辑：杨明丽)

Chemical composition and antibacterial activity of the volatile oils fromMelaleucabracteata

Feng Hao, Zhu Yiming, Wang Wei, Liu Yi, He Jia, Wang Jun, Shan Tijiang

(GuangdongKeyLaboratoryforInnovativeDevelopmentandUtilizationofForestPlantGermplasms,CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)

Using hydro-distillation method, the volatile oil was extracted with a yield of 0.972% from fresh branches and leaves ofMelaleucabracteata. The chemical composition of the volatile oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Totally eighteen components were identified from the volatile oil, which accounted for 99.056% of total volatile substances. Methyl eugenol (92.185%) and methyl cinnamate (3.795%) were the major compounds of the volatile oil. The essential oil showed a certain antibacterial activity on all six tested bacteria, and had better inhibition toPseudomonaslachrymansandAgrobacteriumtumefaciens, with the diameters of inhibition zone of (9.0±0.0) mm and (8.5±0.1) mm, respectively, which was weaker than that of streptomycin sulfate. The diameters of inhibition zone treated with streptomycin sulfate was (18.0±1.0) mm and (21.7±1.0) mm, respectively.

Melaleucabracteata； volatile oil； chemical constituent analysis； antibacterial activity

2016-01-06

2016-02-21

广东省林业科技创新项目(2015KJCH043);广东省普通高校青年创新人才项目(2014KQNCX034)。

S 482.292, TQ 455

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.035

* 通信作者 E-mail:tjshan@scau.edu.cn