李子勇 曾晓宁 满建鲁 闫亮

(山东胜利生物工程有限公司 272000）

畜牧业作为农业农村经济发展的重要支柱产业，为保障国家畜产品供给、增加农牧民收入、改善居民生活水平做出重要贡献。同时，随着经济的发展和人们生活水平的提高，有机畜牧业和绿色畜牧业的转型升级，给养殖业带来严峻考验。国家高度重视畜牧业绿色发展和有机养殖，在动物养殖过程中尽量使用有机饲料和无抗饲料，而饲料来源起决定性作用。在农作物种植过程中，农药残留是影响我国绿色发展和有机养殖的重要因素之一。多杀菌素是全球低毒农药的典型代表，同时也是世界上最具有发展前途的农药。作为一种安全性高，作用位点专一，低毒高效的典型的新型微生物药物具有较好的发展前景。

多杀菌素(Spinosad,1)是由刺糖多孢菌合成的大环内酯类抗生素[1]，分子中含有独特的四环结构，四环母核的9、17位上分别连接有L-鼠李糖和D-福乐糖胺。1类化合物中活性最高的两个组分是spinosyn A和spinosyn D[2]，其他组分活性较弱。目前实验室流行的多杀菌素发酵工艺大多使用植物油或油酸甲酯作为产物合成的碳源，以提高多杀菌素的产量。马坤等[3]研究发现，植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力有比较明显的影响。油酸甲酯和植物油成分类似，是一种不饱和脂肪酸酯，其在发酵液中利用率的高低是影响抗生素效价提高的关键[4]。由于油酸甲酯难溶于发酵液，浓度过高会影响发酵液中的溶氧，对微生物的生产代谢不利，最终会影响产物的合成。因此，多杀菌素发酵工艺一般在基础培养基中添加少量油酸甲酯，中间过程补入一定量的油酸甲酯，保证既能维持发酵液中油酸甲酯的浓度，又不会对菌丝生长及多杀菌素的合成产生不利影响。王美玲等[5]研究发现，油脂的补加种类、浓度、时间会明显影响抗生素的产量，所以深入研究油酸甲酯对发酵过程中微生物的生长状态及次级代谢的影响，确定最佳的补料周期和浓度，对多杀菌素的发酵工艺改进具有重要的指导意义。鉴于此，本文通过基础发酵培养基中油酸甲酯替代淀粉和不同发酵周期添加不同浓度油酸甲酯对多杀菌素发酵合成影响的研究与探讨，为工业化生产多杀菌素提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

原始菌种：刺糖多孢菌，保存于山东胜利生物工程有限公司菌种中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖1.0%、酵母浸粉0.5%、琼脂2.5%、脱脂奶粉0.5%、七水硫酸镁0.1%。

种子瓶培养基：葡萄糖0.5%、玉米淀粉1.5%、酵母粉2%、七水硫酸镁0.25%。

发酵瓶培养基：葡萄糖4%、玉米淀粉6%、棉籽饼粉2%、酵母粉0.8%、麸质粉0.6%、蛋白胨1.2%、甘油0.6%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸亚铁0.0003%、碳酸钙0.6%。

1.1.3 试剂

葡萄糖、酵母浸粉、琼脂、酵母粉、蛋白胨、甘油、碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸亚铁、油酸甲酯等均为国产试剂。

1.1.4 仪器设备

高效液相色谱仪，沃特世科技上海有限公司；气相色谱仪，安捷伦科技中国有限公司；全封闭式摇瓶机，上海世平实验设备有限公司；超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺糖多孢菌的培养

（1)在超净工作台上，刮取约25mm2的斜面菌层，接种到种子瓶培养基中，摇床培养72h，培养条件28.0℃，200r/min。

（2)将种子液取出，在超净工作台上，按照10%的接种量转接至发酵瓶中，在28.0℃，220r/min的条件下，摇床培养280h。研究基础发酵培养基中油酸甲酯替代淀粉和不同发酵周期添加不同浓度油酸甲酯对多杀菌素发酵合成影响。每次设置3个平行样，同时进行发酵。

1.2.2 油酸甲酯含量测定

参照文献[6]。

1.2.3 多杀菌素效价的测定

参照文献[7]。

2 结果与讨论

2.1 基础培养基不同浓度的油酸甲酯等量替代淀粉对多杀菌素发酵影响

多杀菌素发酵过程中，在培养基中添加不同含量的油酸甲酯代替原工艺配方中的淀粉，会对多杀菌素合成产生不同程度的影响，通过试验确定了发酵基础培养基中油酸甲酯的最佳添加量，结果如表1（试验数据均为平均值，下同)。

表1 培养基中不同油酸甲酯替代量对放瓶效价的影响

在培养基中添加油酸甲酯对多杀菌素的合成效果明显，随着油酸甲酯含量由2%增加到4%，放瓶效价达到2065μg/ml，比对照提高29.9%，说明油酸甲酯促进了多杀菌素的生物合成。但当油酸甲酯含量达到6%以后，添加量的增大反而对多杀菌素的合成产生反作用，培养基中添加8%的油酸甲酯时，放瓶效价与添加2%油酸甲酯量的效价差距不大，继续添加可能会对多杀菌素的合成产生不利影响，因此，在摇瓶发酵培养基中油酸甲酯添加量控制在4%最佳。

2.2 发酵过程补加油酸甲酯对多杀菌素合成的影响

2.2.1 72h添加油酸甲酯对发酵的影响

发酵运行至72h时，在摇瓶中分别添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯，监测放瓶时油酸甲酯的残留及效价的变化，分析对多杀菌素合成的影响。具体结果如表2。

表2 72h不同油酸甲酯添加量对油酸甲酯残留及放瓶效价的影响

在油酸甲酯残留上，72h4组摇瓶中的油酸甲酯残留量逐步增加，与添加量有一定的对应关系。效价增长方面，随着添加量增加，效价逐步提升，添加油酸甲酯量6%的组放瓶效价较对照组提高22.7%，但添加量至8%组后，效价反而低于6%添加组。经分析认为，出现以上情况可能因为在一定油酸甲酯浓度范围内，刺糖多孢菌的次级代谢活力最强，油酸甲酯量浓度过低不能充分激活或诱导多杀菌素的生物合成，浓度过高则又抑制了微生物的次级代谢。

在多杀菌素的生物合成上，油酸甲酯添加量在一定浓度限度内时，其效价增长趋势与发酵液中的油酸甲酯的残留量变化趋势类似，说明效价的增长与微生物对油酸甲酯的利用率呈现对应关系，但油酸甲酯的添加超过一定限度后会反过来抑制多杀菌素的合成。

2.2.2 120h添加油酸甲酯对发酵的影响

120h时在摇瓶中分别添加2%、4%、6%、8%油酸甲酯对多杀菌素发酵的影响情况如表3。在油酸甲酯残留方面，与72h添加实验类似，随着油酸甲酯添加量的增加，发酵液中的油酸甲酯残留也逐渐增多，尤其是添加量超过6%以后，油酸甲酯的累计速度加快，说明油酸甲酯的利用率已接近极限。

表3 120h不同油酸甲酯添加量对油酸甲酯残留及放瓶效价的影响

在多杀菌素的合成上，此阶段添加油酸甲酯比72h添加效果更为明显。油酸甲酯添加量2%、4%、6%的3组都增加了产物的合成，只是增加幅度不同，其中以6%的添加量增加最为明显。与油酸甲酯残留趋势类似，加量增加到8%以后，放瓶效价比6%有一定幅度的降低，说明过量的油酸甲酯对菌体的次级代谢产生副作用，抑制多杀菌素的合成速度。

2.2.3 168h添加油酸甲酯对发酵的影响

168h时在摇瓶中分别添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯对多杀菌素发酵的影响情况如表4。在油酸甲酯残留方面可以看出，各个添加梯度残留量基本接近线性关系，说明此阶段添加的油酸甲酯已基本无法被菌体代谢利用，这可能是微生物的代谢能力进一步下降的表现。

表4 168h不同油酸甲酯添加量对油酸甲酯残留及放瓶效价的影响

对多杀菌素合成的影响方面，油酸甲酯添加量为2%、4%、6%虽然都有促进作用，但促进作用已不明显，而且这3个梯度的差别不大，预计后期可能出现产物分解，效价降低。而8%油酸甲酯加量组明显对产物合成有抑制作用，放瓶时效价接近对照组。从整体表现来看，168h时菌体的生长代谢旺盛期已过，菌体已经或接近衰亡期，此时，油酸甲酯添加不当可能会对发酵带来灾难性后果。

3 结论

在发酵工业中，尤其是在抗生素发酵过程中，在培养基中适量添加植物油既可作为消泡剂又可作为碳源参与生产菌的代谢反应[8]。分析多杀菌素合成途径，多杀菌素的合成中需要大量乙酰CoA，乙酰CoA 可由糖酵解途径和脂肪酸分解途径提供[9]。油酸甲酯和植物油类似，其化学结构为不饱和脂肪酸酯，分解后可产生多种短链脂肪酸和酰基CoA，为多杀菌素的生物合成提供前提和能量供应。

本文通过研究在基础培养基和不同的发酵周期补加油酸甲酯发现，发酵过程中油酸甲酯的利用有一定的阶段性，过高的油酸甲酯浓度会对产物的合成产生抑制作用。在发酵液中菌丝活性处于较高水平时，油酸甲酯分解利用率高，可以为菌体对产物的合成提供充分的前提，合成多杀菌素的能力强。油酸甲酯补加实验表明，分别在周期72、120 和168h 时添加不同含量的油酸甲酯，以120h 时补加效果最好，补加量6%最佳，放瓶时油酸甲酯的残留在0.5g/100ml 左右，放瓶效价提高33.6%。本试验为多杀菌素的工业化生产提供可靠依据，而多杀菌素的工业化生产将为我国畜牧业的绿色发展和有机养殖做出重要贡献。