王祥锟，闵祥发，李建政*，张玉鹏（.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨50090；.哈尔滨辰能工大环保科技股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 50078）

产氢产乙酸和产甲烷反应对厌氧消化的限速作用

王祥锟1，闵祥发2，李建政1*，张玉鹏1（1.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨150090；2.哈尔滨辰能工大环保科技股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150078）

为明晰厌氧消化过程的主要限速步骤，分别以丁酸、乙酸、H2/CO2为基质，在37℃和pH 5.00～9.00条件下对厌氧活性污泥进行培养，依据Shelford耐受定律对食丁酸产氢产乙酸菌（SBOB）、乙酸营养型产甲烷菌（ACM）和氢营养型产甲烷菌（HTM）的pH值生态幅及基质转化速率进行分析.结果表明，SBOB、ACM和HTM的pH值生态幅分别为6.19～8.59、5.50～7.74和4.39～9.23，其代谢最适pH值分别为7.39、6.62和6.81.在最适pH值条件下，厌氧活性污泥对丁酸、乙酸、H2/CO2的转化速率分别为0.86、1.04和1.09gCODequ/（gMLVSS·d）.可见，与产甲烷菌相比，产氢产乙酸菌的pH值生态幅更窄，基质转化速率更慢，对厌氧消化过程具有更为显著的限制作用.

厌氧消化；限速步骤；pH值；生态幅；基质转化速率

有机物的厌氧消化是一个复杂的生物转化过程，需要产酸发酵菌群、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等多种微生物类群的协同作用共同完成［1］.这些主要微生物类群在生理生态习性上差别悬殊，如，产酸发酵菌群能够在较为宽广的pH值生态幅内迅速增殖，而产甲烷菌群则要求近中性的pH值环境，而且增殖缓慢［2-3］.所以，要保证系统的稳定运行，须维持各类菌群生长环境的协调和代谢速率的平衡［4］.研究表明，产甲烷菌群可利用的基质仅有乙酸和一碳化合物，增殖和代谢速率缓慢，且对环境变化敏感，其产甲烷反应被认为是厌氧消化的限速步骤［5-6］.有越来越多的研究表明，营养生态位居于产酸发酵菌群和产甲烷菌群之间的产氢产乙酸菌群，其环境适应能力和增殖能力都比较差，其低水平代谢也有可能成为厌氧消化进程的限制因素［7-8］.然而，产氢产乙酸作用与产甲烷作用何者对厌氧消化的限速作用更显著，至今尚不明确［9-11］.

在有机废水厌氧生物处理系统中，产酸发酵菌群代谢产生的挥发性脂肪酸（VFAs）主要有乙酸、丙酸和丁酸等［12］.其中，丙酸和丁酸均须由产氢产乙酸菌群将其转化为乙酸和H2/CO2后才能为产甲烷菌群利用.本文采用厌氧颗粒污泥的间歇培养方法，分别以丁酸、乙酸和H2/CO2为惟一碳源，研究了食丁酸产氢产乙酸菌（SBOB）、乙酸营养型产甲烷菌（ACM）和氢营养型产甲烷菌（HTM）的pH值生态幅及其基质转化速率，并通过对比分析阐述了它们对厌氧消化的限速作用.

1 材料与方法

1.1 接种物

实验所用厌氧颗粒污泥，取自哈尔滨市某大豆蛋白生产企业污水处理站的升流式厌氧污泥床（UASB）反应器.其混合液悬浮固体浓度（MLSS）和挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）分别为63.98和36.79g/L，污泥颗粒直径为1.0～1.2mm，发酵葡萄糖的比产甲烷速率为83.76mL/（gMLVSS·d）.

将原颗粒污泥用无氧水稀释，加玻璃珠震荡破碎，清洗3次后形成的泥水混合物即为接种物，其MLSS、MLVSS、污泥沉降比（SV）、污泥体积指数（SVⅠ）和pH值分别为3.44g/L、2.89g/L、10%、29.10mL/g和7.83.

1.2 静态摇瓶实验

不同基质的甲烷发酵实验，均在容积为180mL的厌氧瓶中进行.每个发酵体系均包含68mL营养液和7mL种泥.其中，以丁酸、乙酸为碳源的发酵体系，分别加有1.2g/L的丁酸和2.4g/L的乙酸，连续充氮5min后封瓶.以H2/CO2为惟一碳源的发酵体系，在营养液分装和污泥接种完成后，连续充入H2/CO2（v：v=80：20）5min，封瓶.营养液的配制参照文献进行［13］.由于培养液中含有KH2PO4和Na2HPO4等酸碱缓冲剂，可保证培养体系在发酵过程中的pH值相对稳定.对丁酸、乙酸和H2/CO2的甲烷发酵测试，均设置5个pH值梯度，分别为5.00、6.00、7.00、8.00和9.00，每个pH值下设置3个平行发酵体系.所有发酵体系构建完成后，置于37℃、140rpm恒温摇床中培养.对于以H2/CO2为惟一碳源的发酵体系，每12h测定发酵气成分一次；对于以丁酸或乙酸为碳源的发酵体系，每48h测定发酵液中的VFAs及发酵气成分一次.

1.3 分析项目及方法

发酵液中的VFAs利用SP6800A型气相色谱仪（山东鲁南虹化工仪器有限公司）检测，毛细管柱30m×Φ0.32mm，填充物为FFAP，柱室温度160℃，气化室和检测器温度均为210℃［14］.发酵气组分（H2、CO2和CH4）利用SP6890型气相色谱仪（山东鲁南虹化工仪器有限公司）测定，不锈钢填充柱2m×Φ3mm，填充物为Porapak.Q，进样室、TCD检测器和柱室温度均为80℃［14］.

发酵液的pH值由pH计（DELTA320， Mettler Toledo）测量，MLSS、MLVSS和SV采用标准方法测定［15］.发酵体系的产气量通过排气法测量，累积产甲烷量按Owen法进行计算［16］.

1.4 数据分析

1.4.1 污泥对基质的转化速率 为比较活性污泥对不同基质的转化速率，将基质丁酸、乙酸和H2换算成当量化学需氧量（CODequ，g/L）［17］. CODequ在线性反应阶段的基质转化速率［qCOD，gCODequ/（gMLVSS·d）］由式（1）计算.

式中：V为发酵体系的体积，L；Δt为线性反应所需时间，d；X为反应体系的生物量MLVSS，g.

1.4.2 活性污泥功能菌群pH生态幅的定量表达 根据Shelford耐受定律，对活性污泥功能菌群的最大基质转化速率与pH值之间的关系进行Gauss Amp非线性拟合［18］.Gauss Amp方程的表达为：

式中：y为最大基质转化速率；x为发酵体系的pH值；xc为功能菌群代谢的最适pH值；w为功能菌群对pH值的耐受度；A和B为常数.xc和w可通过实验数据的拟合获得，菌群的pH值生态幅参数：适宜pH值为［xc-w，xc+w］，耐受pH值为［xc-2w，xc+ 2w］.

1.4.3 平行样品的数据处理 气体体积、发酵气成分和挥发酸组分等数据，均取3个平行测试的平均值.

2 结果与讨论

2.1 SBOB的基质转化与产甲烷特性

在不同初始pH值条件下，厌氧活性污泥对丁酸的转化和产甲烷特征如图1所示.结果表明，当发酵体系初始pH值为7.00时，SBOB的活性较强，发酵体系中的丁酸在18d内有96%左右得到转化，在降解曲线的线性阶段（第8～12d），污泥的丁酸转化速率达到了0.40g/（gMLVSS·d）.随着丁酸的降解，发酵体系的累积产甲烷量不断增加，在第18d培养结束时达到了44.34mL.

图1 不同pH值条件下厌氧活性污泥的丁酸转化和产甲烷特征Fig.1 Performance of the anaerobic activated sludge in butyric acid conversion and methane production with initial pHs

如图1所示，过高或过低的pH值对活性污泥的丁酸转化均有显著影响.初始pH值分别为5.00、6.00、8.00和9.00的发酵体系，在第18d培养结束时，其丁酸转化率分别为15.02%、27.49%、 85.02%和50.08%，污泥的最大丁酸转化速率分别为0.04、0.07、0.30和0.13g/（gMLVSS·d），累积产甲烷量分别为0.22、2.15、39.84和21.84mL，均显著低于初始pH值为7.00的发酵体系.

2.2 ACM的基质转化与产甲烷特性

图2 不同pH值条件下厌氧活性污泥的乙酸转化和产甲烷特征Fig.2 Performance of the anaerobic activated sludge in acetic acid conversion and methane production with initial pHs

以乙酸为惟一碳源的测试结果表明，pH值对ACM的代谢活性也有显著影响.如图2所示，在初始pH值为7.00的发酵体系中，ACM的活性最强，在12d内可将95%左右的乙酸转化.在降解曲线的线性阶段（第4～7d），污泥的乙酸转化速率高达0.82g/（gMLVSS·d）.发酵体系的累积产甲烷量随着乙酸的不断转化而增加，在第12d培养结束时累计48.49mL.过高或过低的pH值对活性污泥的乙酸转化和产甲烷能力也有显著影响.初始pH值分别为5.00、6.00、8.00和9.00的发酵体系，在培养结束时（第12d），污泥的乙酸转化率分别为27.66%、68.96%、41.61%和21.54%，最大乙酸转化速率分别为0.25、0.64、0.29和0.26g/（gMLVSS·d），累积产甲烷量分别为14.37、36.40、21.22和10.89mL，均显著低于初始pH值为7.00的发酵体系.

2.3 HTM的基质转化与产甲烷特性

厌氧活性污泥对H2/CO2的转化和产甲烷特征（图3）表明，HTM具有很强的代谢活性，在初始pH值为7.00的发酵体系中，发酵体系中的H2在4d内几乎全部得到转化.在线性反应阶段（第1～2d），污泥对H2的转化速率达到0.13g/（gMLVSS·d）.发酵体系的累积产甲烷量随着H2的不断转化而增加，在培养结束时（第4d）达到了19.38mL.初始pH值的改变，H2转化速率和累积产甲烷量均受到显著影响.初始pH值分别为5.00、6.00、8.00和9.00的发酵体系，在4d的发酵过程中，其H2转化率分别为61.04%、88.36%、95.38%和30.71%，污泥的最大H2转化速率分别为0.05、0.12、0.09和0.04g/（gMLVSS·d），累积产甲烷量分别为11.55、17.05、17.78和5.91mL，也都显著低于初始pH值为7.00的发酵体系.

图3 不同pH值条件下厌氧活性污泥的氢气转化和产甲烷特征Fig.3 Performance of the anaerobic activated sludge in hydrogen conversion and methane production with initial pHs

2.4 活性污泥功能菌群的pH值生态幅解析

根据式（1）计算不同pH值下的最大基质转化速率qCOD，结果如图4所示.当发酵体系初始pH值为7.00时，活性污泥中的SBOB、ACM和HTM 3种功能菌群均表现出了最大代谢活性，其qCOD分别为0.72、0.88和1.05gCODequ/（gMLVSS·d）.当发酵体系初始pH值降低至6.00时，3种功能菌群的qCOD分别比初始pH值为7.00时降低了0.33、0.18、0.01gCODequ/（gMLVSS·d）.而当初始pH值升高至8.00时，它们的qCOD分别降低了0.10、0.53、0.04gCODequ/（gMLVSS·d）.可见，3种功能菌群的pH生态幅存在显著差异，其中，SBOB的代谢在中性偏碱的条件下最好，而中性偏酸的环境更适合ACM和HTM的代谢.

图4 不同pH值条件下厌氧活性污泥的最大基质转化速率Fig.4 Maximum substrate conversion rates of the anaerobic activated sludge under different pH

依据Shelford耐受定律，利用origin8.5软件进行Gauss Amp非线性拟合（图5），得到3种功能菌群qCOD与pH值之间的关系方程及相关参数（表1）.利用表1中的参数，由式（2）得到SBOB、ACM和HTM的pH生态幅分别为6.19～8.59、5.50～7.74和4.39～9.23，pH值适宜范围分别为6.79～7.99、6.06～7.18和5.60～8.02，最适代谢pH值分别为7.39、6.62和6.81.在最适代谢pH值条件下，活性污泥对丁酸、乙酸和H2的最大转化速率分别为0.86、1.04和1.09gCODequ/（gMLVSS·d）.可见，在厌氧颗粒污泥中，SBOB的代谢水平显著低于ACM和HTM.

图5 厌氧活性污泥中SBOB（A）、ACM（B）和HTM（C）的pH值生态幅Fig.5 pH ecological amplitude of SBOB （A）， ACM （B）and HTM （C） in the anaerobic activated sludge

2.5 产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群对厌氧消化的限速作用分析

由于产甲烷菌的特殊生理生态习性，其产甲烷作用一直被认为是厌氧消化的限速步骤［6］.也有研究表明，产氢产乙酸菌对环境变化同样敏感，增殖代谢速度同样缓慢，其产氢产乙酸作用具备成为厌氧消化过程限速步骤的条件［19］.

如图1～图3所示的实验结果表明，厌氧活性污泥中的SBOB、ACM和HTM代谢活性，均会受到pH值改变的显著影响.而且，3类功能菌群在pH值生态幅和基质转化速率方面都存在明显差异（表1，图4和图5）.如图5所示，SBOB、ACM和HTM的pH值生态幅分别为6.19～8.59、5.50～7.74和4.39～9.23，其中以SBOB的最为狭窄.而表1所示的结果表明，SBOB在最适代谢pH 7.39下的qCOD为0.86gCODequ/（gMLVSS·d），显著低于最适代谢pH值下ACM的1.04gCODequ/（gMLVSS·d） （pH 6.62）和HTM的1.09gCODequ/（gMLVSS·d） （pH 6.81）.可见，与ACM和HTM相比，SBOB具有更狭窄的pH值生态幅和更慢的基质转化速率，对厌氧消化过程的限速作用更加显著.

表1 厌氧活性污泥功能菌群在不同pH值条件下的基质转化速率拟合方程及相关参数Table 1 Substrate conversion rate fitting equations of functional flora in the activated sludge with pHs and the relevant parameters

3 结论

3.1 SBOB的pH值生态幅较ACM和HTM的更为狭窄.在37℃条件下，SBOB、ACM和HTM代谢的pH值生态幅分别为6.19～8.59、5.50～7.74和4.39～9.23.

3.2 最适代谢pH值条件下，SBOB的最大基质转化速率明显低于ACM和HTM.SBOB、ACM和HTM的最大基质转化速率分别为0.86、1.04和1.09gCODequ/（gMLVSS·d）.

3.3 对于厌氧颗粒污泥系统，产氢产乙酸作用对厌氧消化过程的限速作用显著高于产甲烷作用.

参考文献：

［1］ Kwietniewska E， Tys J. Process characteristics， inhibition factors and methane yields of anaerobic digestion process， with particular focus on microalgal biomass fermentation ［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2014，34:491-500.

［2］ 任南琪，王爱杰，马 放.产酸发酵微生物生理生态学 ［M］. 北京:科学出版社， 2005.

［3］ Whitman W B， Bowen T L， Boone D R. The Methanogenic Bacteria ［M］//The Prokaryotes. Springer Berlin Heidelberg，2014:123-163.

［4］ Kato S， Yoshida R， Yamaguchi T， et al. The effects of elevated CO2concentration on competitive interaction between aceticlastic and syntrophic methanogenesis in a model microbial consortium［J］. Frontiers in Microbiology， 2014，5:Article 575.

［5］ Ueno Y， Yamada K， Yoshida N， et al. Evidence from fluid inclusions for microbial methanogenesis in the early Archaean era［J］. Nature， 2006，440（7083）:516-519.

［6］ Liu Y， Whitman W B. Metabolic， phylogenetic， and ecological diversity of the methanogenic archaea ［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2008，1125（1）:171-189.

［7］ Worm P， Müller N， Plugge C M， et al. Syntrophy in methanogenic degradation ［M］. （Endo） symbiotic Methanogenic Archaea. Springer. 2010:143-173.

［8］ Li J， Ban Q， Zhang L， et al. Syntrophic Propionate Degradation in Anaerobic Digestion: A Review ［J］. Ⅰnternational Journal of Agriculture & Biology， 2012，14（5）:668-673.

［9］ Kato S， Watanabe K. Ecological and evolutionary interactions in syntrophic methanogenic consortia ［J］. Microbes and Environments， 2010，25（3）:145-151.

［10］ Tang Y Q， Shigematsu T， Morimura S， et al. Dynamics of the microbial community during continuous methane fermentation in continuously stirred tank reactors ［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2015，119（4）:375-383.

［11］ Plugge C M， van Lier J B， Stams A J M. Syntrophic communities in methane formation from high strength wastewaters［M］//Microbes at Work. Springer Berlin Heidelberg， 2010:59-77.

［12］ 昌 盛，刘 枫.对比分析进水基质浓度对乙醇型和丁酸型发酵制氢系统的影响 ［J］. 化工学报， 2015，66（12）:5111-5118.

［13］ Angelidaki Ⅰ， Sanders W. Assessment of the anaerobic biodegradability of macropollutants ［J］. Reviews in Environmental Science & Bio/Technology， 2004，3（2）:117-129.

［14］ Ai B， Li J， Chi X， et al. Effect of pH and buffer on butyric acid production and microbial community characteristics in bioconversion of rice straw with undefined mixed culture ［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering， 2014，19（4）:676-686.

［15］ American Public Health Association. Water Environment Federation ［M］. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater， 1995，19.

［16］ Owen W F， Stuckey D C， Healy J B， et al. Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity［J］. Water Research， 1979，13（6）:485-492.

［17］ 施 恩，李建政，马天楠.基于VFAs抑制系数的ABR基质降解与产甲烷预测模型 ［J］. 化工学报， 2016，67（7）:2979-2986.

［18］ ter Braak C J F， Looman C W N. Weighted averaging， logistic regression and the Gaussian response model ［J］. Vegetatio， 1986，65（1）:3-11.

［19］ Ban Q， Li J， Zhang L， et al. Quantitative analysis of previously identified propionate-oxidizing bacteria and methanogens at different temperatures in an UASB reactor containing propionate as a sole carbon source ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2013，171（8）:2129-2141.

［20］ Müller N， Worm P， Schink B， et al. Syntrophic butyrate and propionate oxidation processes: from genomes to reaction mechanisms ［J］. Environmental Microbiology Reports， 2010，2（4）: 489-499.

Rate-limiting of hydrogen-producing acetogenesis to anaerobic digestion compared with methanogenesis.

WANG Xiang-kun1， MIN Xiang-fa2， LI Jian-zheng1*， ZHANG Yu-peng1（1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment， Harbin Institute of Technology， Harbin 150090， China；2.Harbin Chenergy Hit Environmental Technology Co， LTD， Harbin 150078， China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：2997～3002

To identify the rate-limiting degree of hydrogen-producing acetogenesis and methanogenesis in anaerobic digestion， anaerobic activated sludge sampled from an UASB was cultivated at 37℃ with a series of initial pH ranged from 5.00 to 9.00. With butyric acid， acetic acid and H2/CO2as substrate， respectively， the ecological amplitude of pH and the substrate conversion rate of syntrophic butyrate-oxidizing bacteria （SBOB）， aceticlastic methanogens （ACM） and hydrogenotrophic methanogens （HTM） were evaluated according to the Shelford's tolerance law. The results showed that the ecological amplitudes of pH for SBOB， ACM and HTM were 6.19～8.59、5.50～7.74 and 4.39～9.23， with an optimal pH of 7.39， 6.62 and 6.81 for their metabolism， respectively. With the optimal metabolic pH， the specific conversion rate of butyric acid， acetic acid and H2/CO2by the sludge was 0.86， 1.04 and 1.09gCODequ/（gMLVSS·d）， respectively. Obviously， the hydrogen-producing acetogens had narrower pH ecological amplitude and lower substrate conversion rate than the methanogens， indicating that hydrogen-producing acetogenesis in the anaerobic activated sludge had a stronger limitation on the anaerobic digestion.

anaerobic digestion；rate-limiting；pH；ecological amplitude；substrate convertion rate

X172，X703

A

1000-6923（2016）10-2997-06

王祥锟（1989-），男，黑龙江穆棱人，哈尔滨工业大学硕士研究生，主要研究方向为厌氧微生物生理生态学.

2016-02-25

国家自然科学基金资助项目（51478141）；城市水资源与水环境国家重点实验室（哈尔滨工业大学）自主课题 （2016DX06）

* 责任作者， 教授， ljz6677@163.com