于 雪

（山东省德州市畜牧站，德州 253000）

奶水牛精原干细胞异种移植进展

于 雪

（山东省德州市畜牧站，德州 253000）

中国是水牛数量居第二位的国家，与牛相比，水牛的基因改造尤其是遗传进展更依赖于新兴动物繁殖生物技术，特别是在干细胞领域，其中精原干细胞介导的转基因技术为水牛的遗传改良带来了广阔的发展空间，而精原干细胞移植是检测精原干细胞功能活性的一项重要技术手段。本文对畜禽精原干细胞移植进行了综述，特别对近几年奶水牛精原干细胞方面的研究进行了重点介绍。尽管跨物种的精原干细胞移植没有提供直接的实际应用，但是它是对分离得到的生殖细胞进行干细胞潜能评定的唯一生物模型，同时有利于探索雄性生殖系干细胞和睾丸生物学功能，以及雄性不育的潜在原因。

奶水牛；精原干细胞；异种；移植

奶水牛经过长期自然选择和进化，形成了耐高温、耐粗饲和抗病能力强等特点，能够很好适应我国南方饲草资源和气候，而水牛奶也因其上佳的品质和口感逐渐受到消费者青睐，因此，奶水牛有极大的发展潜力。我国水牛多为沼泽型水牛，与印度、巴基斯坦等河流型水牛相比，我国水牛繁殖力和产奶量均较低[1]。由于资金、疫情等条件限制，很难从国外大量引进优质水牛。因此，开发和应用水牛繁殖新技术显得尤为重要，特别是在干细胞领域[2]。

在干细胞领域的繁殖新技术中，精原干细胞介导的转基因技术为奶水牛的遗传改良带来了广阔的发展空间，在生殖细胞悬液中精原干细胞无法通过形态学分析与其他A型精原细胞分离开来，但精原干细胞是唯一一种既能自我更新又可向下分化形成精原细胞的干细胞，因此将其移植入缺失精原细胞的受体睾丸内能够定殖并重新填充睾丸，这也正是精原干细胞活性的功能测定方法[3]。该测定方法也用于研究精原干细胞分化相关的基因和调控因子[4]，此外，精原干细胞移植也是辅助生殖和体外介导转基因的一个潜在的技术手段。研究证实利用该技术生产转基因动物，不仅比利用胚胎干细胞制作转基因克隆动物的技术路线简单、成本低廉，还可以克服一些转基因克隆动物未能解决的问题[5]。

1 其他物种精原干细胞的移植基础

1．1 移植前受体动物的制备

成功移植的前提首先便是受体的制备，裸鼠因其缺乏内源生殖细胞从而成为移植实验的理想选择。然而，移植后裸鼠生产的F1代稳定性存在质疑[6]。因此，化学制剂如白消安则被广泛应用于受体小鼠的制备[7]。亚致死剂量的白消安有助于消除内源精子发生但不会损伤曲细精管的微环境[8]。然而，它的作用剂量在不同物种间区别较大，因此需要针对特定物种在移植前进行优化。一般采用不同剂量的白消安肌肉注射受体动物，并通过体重、曲细精管形态和激素分泌水平等因素综合分析白消安对受体动物的影响，适宜剂量需要完全消除曲细精管内的精原细胞但又不破坏支持细胞及龛内微环境，而且又不会对受体动物的体重或激素水平造成不利影响，用以保证供体细胞在受体睾丸内的正常增殖分化。

1．2 精原干细胞的同种移植

受体动物制备技术的成熟便推动了精原干细胞移植的研究，1994年Brinster和Avarbock首次将精原干细胞移植入不育小鼠并使之恢复生育能力，使得供体细胞在受体睾丸中获得了精子发生并可将供体基因型传递到后代生殖系，由此发展了精原干细胞的功能检测法[9]。目前，精原干细胞的鉴定多采用抗原表面标记结合功能检测方法进行鉴定。此后，生殖细胞同种移植已在大鼠、猪、山羊、犬等动物上取得成功，在受体睾丸均可以定植形成克隆[10～12]，而在奶牛上自体移植是成功的，并且形成了完整的精子发生[13]。

1．3 精原干细胞的异种移植

Hamra于2002年将大鼠生精细胞移植到具有免疫缺陷的小鼠睾丸中，获得了完整的生精过程[14]，此项研究的成功为今后该技术在经济动物上的应用提供了参考。将来自其他物种（仓鼠、兔、狗、狒狒、人）的睾丸细胞移植到免疫缺陷小鼠后，可见供体细胞在基底形成供体来源的克隆，但其分化不完整[15,16]。近年来异种移植在畜禽上也取得成功，但是移植效果好坏参半。在牛上的首次报道证实牛的供体生殖细胞在受体鼠睾丸中得以定植及增殖并存活长达两个月[17]。但不同的是，Oatley课题组研究表明供体细胞可以在受体睾丸中成功定植和增殖达80d，并进一步得出小鼠模型可以用来评估精原干细胞的发育进程[18]。在犬、马、猪等异种移植研究中也得到了类似的结果[10,17]。但这些研究一致表明，异种移植的成功依赖于供体和受体物种之间的系统发育距离。

2 水牛精原干细胞的异种移植

2．1 水牛精原干细胞的体外分离培养

而在水牛精原干细胞移植方面的研究较少，大部分研究集中在体外分离纯化和培养。2012年Ahmad对水牛A型精原细胞的分离及纯化程序进行了优化，以不同组份的消化酶进行分离，使用特定的标记加以纯化，结果显示A型精原细胞的比例达50%以上[19]。2012年广西大学石德顺课题组也先后对水牛类精原干细胞进行了体外分离纯化及短期培养，采用胶原酶、胰蛋白酶两步酶消化法消化睾丸组织成功得到大量的睾丸细胞，再经差异贴壁以及Percoll不连续密度梯度离心法分离纯化得到A型精原细胞，细胞悬液体外培养2d后开始增殖，10～20d左右形成类精原干细胞克隆，且发现培养基中添加血清及GDNF对精原细胞分裂增殖及克隆形成有促进作用[20]。

2．2 水牛精原干细胞的异种移植

最终确定水牛SSCs移植成功与否，最关键的因素是确定受体睾丸组织内供体细胞遗传物质的存在。近期扁豆凝集素（DBA）已被鉴定得知是水牛精原干细胞的特异性标记物[19]。2012年Mahla分离得到水牛的精原细胞悬液直接用于异种移植，于移植后30d收集受体鼠睾丸进行DBA免疫组化证实并非全部的供体细胞均可定植，而且这部分定植细胞表现出POU5F1强阳性，既建立了小鼠异种移植模型，也验证了分子标记POU5F1的特异性[2]。这项研究极大地推动了精原干细胞的体外分离培养和鉴定，2014年杨利国课题组通过剂量优化后的白消安制备昆明小鼠受体，并通过异种移植将体外转染的水牛精原干细胞注射入受体曲细精管，应用DBA免疫组化和PCR方法检测供体精原细胞的存在，发现水牛睾丸细胞作为新鲜的供体，在受体鼠的睾丸曲细精管中可见形成圆形的细胞克隆，但是2个月后，受体睾丸中克隆数减少，并且这些细胞表现为纤维组织细胞形态并失去了生精能力。研究结果显示，用白消安处理的昆明小鼠睾丸能够实现水牛精原干细胞的克隆和增殖，从而使其成为合适的动物模型用于评估供体细胞的干细胞潜能，且证实水牛精原干细胞在受体小鼠睾丸中可以存活并增殖达2个月[21]。

3 异种移植后供体源精子发生

迄今为止，仅限于与受体系统发育相近的物种能够成功获得供体来源的精子发生。除了小鼠对小鼠的同种移植，大鼠到小鼠[22]、仓鼠到小鼠[23]以及小鼠到大鼠的异种移植都观察到供体源精子发生。但是仓鼠移植到受体小鼠后，获得的仓鼠精子形态上有缺陷，造成这一结果的主要原因是影响精子最终分化的是受体（小鼠）的支持细胞，而供受体物种又存在差异，因此供体精子在发育中出现形态学错误。而在杨利国课题组的研究中，奶水牛精原干细胞在移植后一个月内受体睾丸内存在迁移和定植现象，之后一个月供体细胞克隆数逐渐减少，只是偶见体细胞形态的供体来源细胞，同样说明小鼠睾丸的支持细胞难以维持奶水牛精原干细胞的精子发生，类似的结果在牛对小鼠异种移植中也出现过[18]。

4 精原干细胞移植生产转基因动物

由于精原干细胞（SSCs）是成年动物体内唯一具有自我更新潜能的干细胞，在雄性动物整个的生命过程中不断支持精子发生，因此在体外培养的同时若进行转基因改造，待移植到内源性精原细胞缺失的受体睾丸，含有目的基因的供体细胞便可在受体睾丸内环境中获得精子发生，通过人工授精产生大量转基因后代，从而使其成为一个潜在的新型转基因技术。

Brinster和Avarbock等最早开展生殖细胞移植制备转基因动物的工作，该课题组于1994年将携带有lac-Z基因供体小鼠的睾丸混合悬浮液，利用显微注射法移植入另一只不育受体小鼠的曲细精管内。结果显示供体SSCs获得精子发生过程，并能产生形态特征正常的携带 lac-Z 基因的成熟精子细胞[9]。而之后2001年Nagano采用逆转录病毒载体感染小鼠睾丸细胞，同种移植后获得了含目的基因的干细胞克隆，但由于转染效率和繁殖率低未能产生转基因后代[15]。然而随后这个问题得已解决，目前此项技术在啮齿类模型动物上的研究已经很成熟，且已在多种物种包括大家畜上实现应用。Dobrinski 实验室[24]在2008年成功地利用腺病毒介导的方法直接将外源基因转入山羊的精原干细胞内，然后将精原干细胞移植进事先经过辐射处理的受体山羊睾丸并且产生了大量精子，再利用体外受精的方法，成功地监测到10%的胚胎为转基因胚胎，这进一步证明了精原干细胞转基因及移植在家畜等大型动物转基因应用上的可行性。

另外，人们还进行了异种移植介导转基因的尝试，1999年Ogawa将携带有lac-Z基因的大鼠SSCs在体外进行大量增殖后注入免疫缺陷的小鼠睾丸内，结果发现，大鼠SSCs也出现了生精的过程[25]。2014年，杨利国课题组成功地获得了以PB转座子介导的转基因水牛精原干细胞，并经异种移植到受体昆明种小鼠中，该移植模型证实了转基因处理的SSCs仍具有增殖和分化潜能，这为今后通过同种移植生产转基因水牛提供了理论和技术支持[21]。

5 结语

综上所述，精原干细胞同种和异种移植技术为探索雄性生殖细胞系和睾丸功能及潜在影响雄性生育能力的原因提供了强有力的基础生物学方法。同种移植可以在家畜生殖细胞系的遗传改良、珍稀动物或者濒危动物繁殖力的保持提供应用，尽管跨物种的精原干细胞移植碍于进化距离的障碍，暂时没有提供直接的实际应用，但是它是对分离得到的生殖细胞进行干细胞潜能评定的生物模型[26]，同时也有利于探索雄性生殖系干细胞和睾丸生物学功能，以及雄性不育的潜在原因。而由两者介导的转基因技术在转基因动物生产方面有着明显的优势，例如与受精卵显微注射法相比，降低了对技术和仪器的要求；与胚胎干细胞法相比，操作简单且材料来源广泛；与精子载体法相比，精原干细胞可以增殖分化产生数量更多的转基因后代。不过截至目前，通过精原干细胞移植法生产转基因动物只在有限的种属中实现，但相信随着越来越多体外培养体系的建立，这种转基因动物的生产策略将有不可估量的应用价值。

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Progress of Xenotransplantation in Dairy Buffalo Spermatogonial Stem Cells

YU Xue
(Animal Husbandry Station of Dezhou, Dezhou 253000)

Chinese ranks second in the number of buffalo worldwide. Comparing with cattle, genetic modification especially genetic progress in buffalo is more dependent on the emerging animal reproduction biotechnology, especially in the field of stem cells. In which, spermatogonial stem cell mediated transgenic technology brought a broad space for genetic improvement of buffalo, and stem cell transplantation is an important technical means to detect the activity of spermatogonial stem cell function. This paper introduces the spermatogonial stem cell transplantation in livestock, emphasizing spermatogonial stem cell research in dairy buffalo in recent years. Although cross species spermatogonial stem cell transplantation provides no direct practical application, it is still the only biological model evaluation of stem cell potential for the isolated germ cells. It is also conducive to the exploration of male germline stem cells and testicular function, as well as the potential causes of male infertility.

Dairy buffalo; Spermatogonial stem cells; Cross species; Transplantation

S823.3

A

1004-4264（2017）05-0012-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.004

2016-12-08

于雪，女，博士，从事畜牧兽医工作。