许光勇王朝军周海深徐利

（1北京养猪育种中心，北京100194；2中国农业大学动物医学院，北京100193）

猪瘟诊断技术的应用进展

许光勇1,2王朝军1周海深1徐利1

（1北京养猪育种中心，北京100194；2中国农业大学动物医学院，北京100193）

猪瘟是一种急性、热性和高度接触性传染病。该病没有区域性，呈世界性分布，给全球养猪业造成巨大经济损失。目前猪群感染猪瘟病毒无有效治疗措施，完全依靠疫苗接种和加强生物安全体系管理进行预防。虽然中国C株对猪瘟的消灭和防控起到了重要作用，但近年来猪瘟却表现出复发趋势，呈现非典型症状或隐性感染状态，故在没有出现典型症状的情况下，如何快速、精准地做出诊断显得极为重要。文中就数十年来国内外所开发或使用过的猪瘟诊断技术作一综述。

猪瘟；诊断技术；进展；应用

猪瘟（Classical Sw ine Fever,CSF）是由黄病毒科瘟病毒属中的猪瘟病毒（Classical Sw ine Fever virus, CSFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，俗称“烂肠瘟”。世界动物卫生组织（OIE）在《国际动物卫生法典》中将其列为必须报告和重要检疫对象的A类动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病[1,2]。猪瘟病毒可感染各个阶段猪群，分别可导致母猪群出现流产、产死胎和木乃伊胎及弱仔比例升高，公猪群呈现精液带毒，产房哺乳仔猪出现腹泻、发病死亡率升高，以及中大猪群出现以发热、全身如针尖点状出血、肠管糜烂或脾梗死等症状为主要特征[3]的发病。猪瘟对全球养猪业来讲可谓是毁灭性打击。当前，感染猪瘟病毒后治疗基本无效，对猪瘟防控主要是采取预防措施，即疫苗免疫配合生物安全的综合管理措施。目前大部分使用的猪瘟活疫苗为猪瘟兔化弱毒株（C株）疫苗，经细胞扩大培养后制成细胞苗接种使用，也有部分是将毒株接种动物采集组织制成脾淋苗后使用，以及其他一些核酸疫苗、基因缺失疫苗及DNA疫苗等[4]。郑庆端等于2005年报道，在接种C株猪瘟活疫苗4天后即可部分产生免疫力。在养猪实际生产中，接种猪瘟活疫苗2～3周后，约80%的猪群能够产生有效保护抗体。近年来在中国，猪瘟虽不呈现暴发形势，但仍有零散发生，呈现温和感染状态，对猪场尤其是种猪场造成隐性危害。在欧洲、南美洲等地区呈现复发趋势，且一些宣布已经消灭猪瘟的国家再次出现猪瘟复发的报道[4]。因此，对猪瘟病毒是否感染及猪瘟病毒的诊断工作应做出更高、更精准的要求和标准，故多种猪瘟诊断方法孕育而生。

猪瘟自1833年在美国俄亥俄州发现以来，在全球范围内流行传播[5]。但随着养猪业的发展，猪瘟诊断技术越来越多，重复性和可靠性也越来越高，由数十年前的流行病学调查统计、临床表现和病理解剖变化的主观判断，到如今常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）法、免疫荧光试验、实时定量PCR或基因芯片检测等实验室检测技术，无疑对猪瘟病毒感染确诊起到促进作用。

1 猪瘟病原与流行特征

猪瘟病毒是单股正链RNA病毒，病毒粒子直径约40～50 nm，呈球形，核衣壳为二十面体对称，基因组全长12.3 kb，有一个大的开放阅读框并能编码含3 898个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，产生4个结构蛋白（C、Erns、E1和E2）和8个非结构蛋白（Np ro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），而E2蛋白即能诱导产生猪瘟保护性抗体[4,6]。

在我国，首次发现猪瘟的时间是1925年。1954年，我国老一辈科学家成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，该毒株一直延续使用至今并取得良好的免疫效果，世界上其他一些国家借助于该毒株疫苗成功完成猪瘟净化与根除工作，而中国于1956年就提出消灭猪瘟计划，至今已60年时间，猪瘟仍存在于全国范围内的养殖场，故我们还有很长一段路要走，尤其是把精准确诊作为前提[7]。

猪瘟一年四季均可发生，对各个阶段、品种、性别的猪群均易感，无地方流行性，一般可通过水平和垂直传播，也可以通过蚊虫等媒介传播，猪瘟病毒对碱性消毒药如苛性钠或生石灰等敏感。随着时间推移，猪瘟病毒为适应环境生存而不断发生新的变化，故其所表现的临床反应也越来越复杂。

2 临床症状

猪感染猪瘟病毒后，其潜伏期一般为5～7天，根据养殖环境差异、区域性病毒流行性、猪群健康度以及综合管理水平等条件不同，其表现出的病程长短不一，临床症状会有所差异，通常可将其分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、温和型和繁殖障碍型[8]。受到猪瘟病毒感染，可能会出现体温升高呈稽留热、全身性出血（点）或妊娠母猪流产及所产死胎、木乃伊胎和弱仔数量增加等临床表现。

突然发病并迅速死亡的多为最急性型猪瘟。急性型猪瘟通常可见体温升高至41～42℃、食欲不振、扎堆嗜睡、结膜炎、皮肤黏膜广泛充血出血。亚急性型与急性型猪瘟症状非常相似，但其病程稍长，通常在一些老疫情区或管理不到位的猪场发生。慢性型猪瘟主要表现为被毛粗乱、精神萎靡、渐进性消瘦、体温忽高忽低、便秘与腹泻交替，病程可持续三个月以上，死亡率在10%～30%之间。温和型猪瘟是目前最流行的一种，感染后可能不出现任何临床症状，但猪群尤其是种猪群长期带毒和排毒，通过水平和垂直传播方式导致猪瘟病毒在本场内循环感染。繁殖障碍型猪瘟往往呈现出混合感染情况，例如与圆环病毒、蓝耳病病毒等共同存在，导致母猪流产或早产、产死胎木乃伊胎和弱仔数量增加。无论是何种类型猪瘟，若通过临床症状表现来进行判断，应该眼观看到高烧稽留和出血性素质，二者往往缺一不可。

3 病理解剖变化

根据猪瘟病毒毒力强弱和机体自身免疫状态，感染猪瘟病毒后其表现的病理变化各不相同。最急性型偶尔在黏膜浆膜、肾脏、心脏包膜或外膜以及膀胱黏膜表面见到少量细小的点状出血，淋巴结轻微肿胀。病理变化最明显的应该是急性型，具有典型的败血症变化，可见皮肤全身性出血，全身淋巴结肿胀、深红色、切开呈红白相间的大理石样外观，脾脏边缘出现出血性梗死，肾脏实质性变性，经常出现麻雀肾，切开肾脏可见髓质和皮质均有点状或线状出血，消化道有出血点或出血斑，严重者可见形成溃疡灶，肝脏变性质脆，呼吸系统和心血管均可见出血斑点[9]。其他类型猪瘟无特别典型病理变化，需结合其他信息或实验室检测结果进行判断。

4 实验室诊断技术

猪瘟诊断技术较多，既可以鉴定病原又可以检测抗体，方法包括实验室常见的免疫荧光试验（FAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、琼脂扩散试验（AGP）和间接血凝试验（IHA）等方法，分子生物学检测技术包括反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、巢式PCR、多重引物PCR、环介导等温扩增技术（RT-LAMP）等，另外还有一些基因芯片检测技术和核酸探针技术用于猪瘟病毒诊断工作[6,10]。

4.1 常规诊断技术

4.1.1 免疫荧光试验

免疫荧光试验（FAT）是检测猪瘟的常用方法，其原理是将抗猪瘟病毒抗体IgG提纯并标记荧光物，做成荧光试剂并用于扁桃体或淋巴结等病料的触片或冰冻切片进行着色或染色，然后借助于荧光显微镜观察，在显微镜下若能看到绿色荧光，表明猪瘟病毒抗体染色为阳性结果。FAT可有效提高早期感染猪瘟病毒检出率，对强毒株和弱毒株均有较高的准确性，且使用范围广，在某些大型规模化猪场比较适用，对于猪瘟防控起到极其重要的意义。FAT与其他方法相比，具备诊断所需时间短、检出率高、准确性强的优点[11]。

FAT包括组织直接免疫荧光试验、细胞培养直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验。组织直接FAT主要是利用所采集的组织或脏器，用石蜡包埋或冰冻切片进行固定，再用猪瘟特异性荧光抗体进行染色并在荧光显微镜下观察，若出现亮绿色荧光即表明有猪瘟病毒存在。细胞培养直接FAT主要是将可疑病料匀浆制成上清液接种于PK-15细胞进行增殖培养，加入酶标抗体染色，然后肉眼观察即可。间接FAT直接在可疑组织上滴加抗猪瘟阳性血清（1∶4）作用30分钟，洗涤后加入羊抗猪IgG荧光抗体作用30分钟，漂洗干燥后于荧光显微镜下观察结果[12]。何若钢等2008年利用免疫荧光试验技术对广西十几个猪场进行猪瘟调查，结果表明外表看似健康且无任何临床症状的猪群猪瘟抗原阳性率高达7.21%。自1965年Robertson报道以来，FAT是国内外最常用的方法之一，该方法直观、可靠，广泛应用于组织病料的猪瘟病毒检测，适用于早期感染和无明显临床症状的带毒猪排查。

4.1.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是世界动物卫生组织推荐的血清抗体检测方法，具有一定敏感性和特异性，可用于猪群抗体监测和抗原检测，目前也是规模化养殖场普遍采用的一种检测技术。ELISA法是利用抗原抗体发生反应的原理，包括间接ELISA、竞争ELISA、抗原捕获ELISA、Dot-ELISA和微波快速ELISA，各种方法均有优缺点[8]。周宗安、杨晓梅和Leforban、丘惠深以及Hergarten等通过大量试验证明ELISA法的敏感性和特异性。由于具备高敏感性和特异性、试剂稳定无放射性和可操作性强等特点，该方法成为很多猪场和实验室常用的血清学检测方法。

4.1.3 间接血凝试验

间接血凝试验（IHA）的原理为将抗原或抗体包被于红细胞表面作为载体，然后与相应的抗体或抗原结合，发生红细胞凝集反应，其包括正向和反向IHA。正向IHA用于检测血清中猪瘟抗体，反向IHA用于检测组织病料中猪瘟抗原。

4.1.4 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验（AGP）是利用可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶内扩散形成白色沉淀的原理，包括单向和双向AGP。该方法简单，但特异性和敏感性较差，通常不采用。

4.1.5 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术具有灵敏度高和操作简单等优点，发展和应用前景十分广阔。陈龙宾等在2007年建立了猪瘟胶体金免疫层析快速诊断方法。

4.2 分子生物学检测技术

随着分子生物学技术的发展，其在猪瘟检测上的应用越来越多。利用分子生物学技术检测猪瘟病原主要是PCR，不同类型PCR都是针对猪瘟病毒进行诊断。RT-PCR利用特异性引物将猪瘟病毒核酸进行反转录，经PCR一系列反应扩增，然后将扩增产物进行凝胶电泳和染色，从而判定是否存在病毒感染。巢式PCR使用2对引物进行扩增即二次扩增，然后进行观察判定。多重PCR是应用多对引物同时扩增，对引物设计要求较高。RT-LAMP是新建的一种恒温核酸扩增技术，针对靶基因6个区域设计4对特异引物，在等温条件下完成扩增反应[13]。实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）和前面4种有所区别，前4种是从定性方面进行判断，而Real-Time PCR是从定量的角度进行判断。

不同类型PCR优缺点各异，现简单阐述如下：RT-PCR操作简单、灵敏度和特异性高、重复性好，对猪瘟病毒识别性很强，检测范围广泛，在临床诊断中发挥着重要作用。巢式PCR利用2对引物，其扩增特异性和灵敏度得到进一步提高。多重PCR是采用2对或更多引物扩增，但对引物设计要求更高。环介导等温核酸扩增技术无需借助仪器即可观察结果，为基层和现场检测提供便利，故具有良好的推广应用前景[6,11]。Real-Time PCR能够解决普通PCR假阳性问题，分析感染病毒数量，无需电泳操作，但由于该技术受到PCR等仪器要求较高、所用试剂成本较高等因素制约，故没有在基层推广开[14]。曾小娜等2009年分别采用RT-PCR和RT-LAMP法对80份可疑样品进行猪瘟病率分别为36.25%和38.75%。Chen等2009年同样用RT-PCR和RT-LAMP法对可疑样本检测猪瘟病毒，检出阳性率分别为78%和89%。RT-LAMP法的敏感性较普通RT-PCR高。Le等[15]通过4 710份样品证实Real-Time PCR方法敏感、特异、快速和高通量。Das等[16]采用Real-Time PCR对早期感染猪瘟病毒的血液样品检测，具有极高的灵敏度。Hoffmann等[17]将建立的检测猪瘟病毒的Real-Time PCR技术与商业化试剂盒比较，在临床应用中显示出良好的灵敏性和特异性。

4.3 基因芯片检测技术

生物芯片技术是根据分子间特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面的微型生物化学分析系统，对细胞、蛋白和基因等进行快速准确地检测。若细分的话，可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片，其中基因芯片是近年来的研究热点。杨林[18]2005年通过基因测序，对分离的猪瘟野毒毒株进行鉴定，并对E2基因进行序列分析，在与传统的石门毒株和疫苗毒株比较后，发现分离到的猪瘟野毒与疫苗毒存在一定差异，且E2基因部分序列接近Alfort，但与Brescia同源性最低。虽然基因芯片检测技术优点较多，但处于探索阶段，高成本等制约因素仍是该技术大面积推广亟需解决的难题。

5 动物回归试验

动物回归试验是最经典和可靠的方法。通常是采集有猪瘟典型病变的组织，经过碾磨、破碎、离心等处理后提取病毒，一方面可进行猪瘟病毒分离鉴定，另一方面可以将病毒感染健康（SPF）猪，然后观察有无猪瘟临床症状。该方法处理过程比较复杂，耗时较长，且回归本体动物只能在小范围内试验，以避免病原传播的风险，不利于疾病防控。

6 其他相关诊断技术

随着科技不断进步，分子生物学技术占据了半壁江山，在猪瘟诊断技术方面还包含一些不常用方法，例如家兔交互免疫试验、金标卡诊断技术、核酸探针技术等。这些诊断技术或是处于开发探索阶段，或是不适合科学技术进步的步伐而被淘汰。

7 展望

我国虽是养猪大国，但不是养猪强国。随着养猪业迅速发展，养猪技术也不断得到提高，但猪病却越来越多、越来越复杂。借助于中国C株猪瘟疫苗，欧美一些发达国家已经将猪瘟彻底消灭。在中国，严重困扰养猪业的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、口蹄疫和猪流行性腹泻等仍将长期存在，如何有效控制甚至消灭这些传染病，是我们兽医工作者今后的工作重点。目前在我国，猪瘟虽没有大面积暴发，但在全国范围内仍呈零散温和发生，且容易导致基层兽医人员误诊，因此，准确诊断是控制和净化猪瘟的基础工作和重要前提。目前，部分经验丰富的猪场专职兽医技术人员可通过猪场疾病背景、生产数据分析、流行动态、临床症状和病理变化等现场资料进行初步诊断，如需确诊还是要借助于实验室诊断技术。猪瘟诊断最常用的实验室方法包括ELISA和RT-PCR法。美国IDEXX公司有商品化ELISA抗体和抗原检测试剂盒，但ELISA法容易出现假阳性，准确性和特异性均有待提高；RT-PCR法准确度高，但需要采集脏器等组织样品，对于活体猪只来说采集扁桃体操作困难，且对猪只应激大。如何制定一种操作便捷、特异性强、灵敏度高、可重复性好、适合中国养猪业使用的诊断技术是我们不断追求的目标。

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S854.43；S858.28

A

1673-4645(2017)05-0060-05

2016-11-02

北京三元种业科技股份有限公司自立课题（SYZYZ20150005）

许光勇，男，江西金溪人，在读博士研究生，兽医师，国家执业兽医师，主要从事规模化猪场生产管理与猪病防控研究，E-m ail：vetbbsc@163.com