左丽丽,富校轶,高永欣,孙茂成,王振宇,王舒然,*

(1.吉林医药学院,公共卫生学院,吉林吉林132013;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)



狗枣猕猴桃多酚对60Coγ射线辐射防护作用的研究

左丽丽1,富校轶1,高永欣1,孙茂成1,王振宇2,王舒然1,*

(1.吉林医药学院,公共卫生学院,吉林吉林132013;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)

以狗枣猕猴桃为原料,研究分离纯化的狗枣猕猴桃多酚(AKP)的辐射防护作用。雄性昆明小鼠随机分为6组:正常对照组、辐射模型组、利可君片组(1.4 mg/kg·d)、狗枣猕猴桃多酚低、中、高剂量组(分别为50、100、200 mg/kg·d),连续给药14 d,除正常对照组外所有小鼠采用60Coγ射线进行全身照射,剂量率为0.792 Gy/min,辐射剂量为6.0 Gy,辐射后观察小鼠体内抗氧化物酶以及丙二醛(MDA)的表达情况,同时测定还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。结果表明:与对照组相比,模型组小鼠各组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性降低(p<0.05),MDA含量升高(p<0.01)。与模型组相比,中剂量的AKP能够显著提高辐射小鼠体内SOD的活性(p<0.05);低剂量AKP能够使心脏、肾脏、血浆中CAT活性基本恢复到正常对照组水平;中剂量AKP使肝脏、脾脏、血浆中GSH-Px活性显著提高(p<0.01),不同剂量的AKP能够有效降低辐射小鼠各组织中MDA含量(p<0.05);中剂量的AKP使机体各组织中乳酸脱氢酶(LDH)的活性基本恢复到正常水平。但是总体效果不及利可君片。因此,狗枣猕猴桃多酚可一定程度地保护机体,减少氧化损伤对机体造成的不良影响,也为其进一步开发利用提供了科学依据。

狗枣猕猴桃,多酚,氧化损伤,辐射防护

科技的不断进步以及生物技术的迅速发展增加了人体暴露在电离辐射中的机会,例如核辐射、空间环境、放射医疗等辐射给人体造成了极大的危害,导致机体直接或间接性的损伤,引起氧化应激,产生大量的活性氧自由基,攻击生物大分子如DNA、蛋白质、脂类等,从而产生一系列的链式反应,最终导致癌症、炎症、畸形以及孕妇流产等一系列疾病[1-5]。因此,辐射损伤引起了人们的广泛关注[6],为了有效预防辐射对机体造成的损伤,人们一直致力于辐射防护作用的研究,然而,大多数合成辐射防护剂都具有毒副作用,不能长期服用等特点。多酚、黄酮类、花色苷、多糖等天然产物由于其超强的抗辐射作用,且具有安全、毒副作用小的特点而备受关注[7]。研究显示,松多酚、元蘑多糖、大豆异黄酮、蓝靛果以及越橘花色苷等天然成分能降低脂质过氧化反应,增加体内抗氧化物酶的活性[8-12],同时能够修复DNA的损伤,提高细胞的生存率[13-14]。前期研究发现狗枣猕猴桃多酚具有非常好的体外抗氧化能力[15],因此,本文通过60Coγ射线诱导小鼠建立氧化损伤模型,研究狗枣猕猴桃多酚对机体抗氧化酶系表达的影响,研究其辐射防护作用,为进一步开发安全高效的天然抗辐射食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

狗枣猕猴桃野生浆果 采摘于黑龙江省大兴安岭地区;狗枣猕猴桃多酚(AKP,纯度为38.6%) 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院生物化工实验室制备[16];利可君片 江苏吉贝尔药业有限公司;考马斯亮兰蛋白测定、MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH试剂盒 南京建成科技有限公司;清洁级雄性昆明小鼠 6～8周龄,体重(22±2)g,许可证号:SCXK(黑)2013-001，购于哈尔滨医科大学肿瘤医院动物实验中心。

HR2006型料理机 飞利浦电子香港有限公司;TDZ4-WS型低速离心机 湖南湘仪实验仪器有限公司;Sp-752PC型紫外可见分光光度计 北京光谱仪器有限公司;RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;KQ-5200超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FD-18真空冻干机 上海田枫实业有限公司;恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;HT-2酶标仪 Biocell公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠辐射损伤模型的建立 雄性昆明小鼠,6～8周龄,体重(22±2) g,保持实验室温度在(25±2) ℃,相对湿度在40%～50%,适应性喂养一周,此期间所有小鼠自由摄食和饮水。适应期后,将小鼠随机分成六组(正常对照组,辐射模型组,阳性对照组,AKP低、中、高剂量干预组),每组20只小鼠,并进行组内和组间标记。AKP低剂量干预组:50 mg/kg·d;AKP中剂量干预组:100 mg/kg·d;AKP高剂量干预组:200 mg/kg·d,阳性对照组:1.4 mg/kg·d利可君片;正常对照组和模型组灌胃一定体积的生理盐水。每天上午9:00进行灌胃,连续灌胃14 d,第15 d用60Coγ射线辐射,剂量率为0.792 Gy/min,辐照时间10 min 40 s,皮源照射距离为170 cm,剂量为6.0 Gy,辐射后第2 d摘眼球取血,脱臼处死,迅速剥离小鼠的心、肝、脾、肾等组织,放置在4 ℃预冷的生理盐水中清洗3次,去除血污及结缔组织,然后用滤纸将脏器表面的水分吸干,并称重记录。

1.2.2 组织匀浆液的制备及蛋白含量测定 小鼠组织匀浆液的制备:将小鼠心、肝、脾、肾置于研钵中,向其中加入少许液氮,用钵杵将其快速磨碎,使组织充分匀浆,加入一定体积的0.86%生理盐水,将其充分混匀,转移至离心管中,补充生理盐水的总体积至组织重量的9倍,制成10%的组织匀浆液,以1000 r/min的速度离心10 min,弃去沉淀取上清液分装,-80 ℃保存备用。各组织匀浆液蛋白含量的测定按照考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 体内相关过氧化物酶活性的测定 取一定体积的1.2.2步骤中的组织匀浆液,测定心、肝、脾、肾、血浆等各组织中MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH、GSH的活力严格按照南京建成试剂公司提供的试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计与分析

每组实验进行三次重复,数据以平均值±标准差表示,采用Original 8.5进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 AKP对小鼠体重的影响

以60Coγ-射线诱导小鼠建立氧化损伤模型,测定辐射损伤对动物机体中各指标的影响。给药期间AKP对小鼠体重动态变化的影响如图1所示,可见,氧化损伤前小鼠的体重组内和组间没有显著的变化,均呈缓慢增长的趋势,灌胃10 d后高剂量组体重出现些许降低的趋势,其他剂量组之间的体重变化没有显著性差异。表明AKP和利可君片选取的剂量对小鼠的生长没有急性毒性。氧化损伤后模型组小鼠受到大剂量γ射线的全身照射,使其出现精神不振、食欲不佳,饮食量和饮水量下降等现象,从而导致辐射后小鼠的体重出现一定程度的降低,而灌胃AKP和利可君片的小鼠体重也有所降低,但降低幅度小于模型组,且组间差异不显著,同时给药组小鼠的精神状态良好,这表明狗枣猕猴桃多酚和利可君片在一定程度上缓解了氧化损伤导致的小鼠体重降低,减少氧化损伤的症状。

图1 AKP对小鼠体重的动态变化Fig.1 The changes of body weight in experimental period

表1 AKP对辐射小鼠各组织和血浆中MDA含量的影响

注:各组织中MDA含量单位为nmol/mg prot;血浆中MDA含量单位为nmol/mL;#与正常对照组存在显著性差异,p<0.05,##与正常对照组存在极显著性差异,p<0.01;*与辐射模型组存在显著性差异,p<0.05,**与辐射模型组存在极显著性差异,p<0.01；表2～表6同。

表2 AKP对辐射小鼠各组织及血浆中SOD活性的影响

注:各组织中SOD含量单位为U/mg prot;血浆中SOD含量单位为U/mL。2.2 AKP对体内MDA及相关抗氧化酶活力的影响

2.2.1 AKP对机体MDA含量的影响 MDA的产生是衡量机体自由基代谢的敏感指标,其含量的多少反映出氧自由基生成与否以及脂质过氧化的程度[17]。AKP对辐射小鼠各组织及血浆中MDA含量的影响如表1所示。与正常对照组相比,辐射后各脏器组织中MDA含量极显著增加(p<0.01),表明6.0 Gy的辐射剂量导致小鼠各组织器官产生了明显的脂质过氧化反应,即氧化损伤模型建立成功。与模型组相比,加药后阳性对照组MDA含量都极显著降低(p<0.01),即利可君片能够防止机体发生脂质过氧化反应,起到很好的防护作用。AKP低、中、高剂量组中MDA的含量显著低于辐射模型组(p<0.05),这表明狗枣猕猴桃多酚对辐射引起的氧化损伤具有很好的防护作用。而肾脏和血浆中MDA含量表明AKP中剂量组效果较好,显著地优于低、高剂量组。分析其原因可能是给药浓度过高,对机体的肾脏和血液系统产生了一定的毒副作用,使得高剂量组小鼠各组织和血浆中的MDA含量偏高,同时小鼠个体之间的差异也是导致此现象的一个重要原因。

2.2.2 AKP对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 AKP对辐射损伤小鼠各组织及血浆中SOD活力的影响如表2所示,与正常对照组相比,辐射后模型各组织中SOD的活性显著下降(p<0.05),辐射前灌胃利可君片和AKP后,利可君片及低、中剂量组小鼠各脏器组织和血浆中SOD活力显著提高(p<0.05),使辐射后机体SOD的水平得到有效的恢复,基本保持在正常水平,使其免受辐射造成的严重损伤。但是当AKP浓度较高时,达到200 mg/kg·d时,各组织中SOD的活力相对于模型组有一定程度的改善(p<0.05),但是效果不及低、中剂量组,这表明一定剂量的AKP能够提高机体SOD活力,抑制辐射对机体造成的严重损伤。机体受到损伤后,自由基产生增加,机体本身能够通过自我调节能力提高体内SOD的水平,有利于对超氧自由基的清除,而灌胃AKP和利可君片组的机体自我调节能力明显大于辐射模型组,因此,SOD的超表达也可能是各脏器组织增加脂质过氧化反应的适应性反应,它的高活性可能是通过增加超氧化物阴离子的产生而诱导的[18]。

2.2.3 AKP对过氧化氢酶(CAT)活性的影响 CAT存在于能呼吸的生物体内,主要存在于动物的线粒体,内质网以及动物的肝脏和红细胞中,其活性为机体提供了有效的抗氧化防御机制。不同来源的CAT具有不同的结构,在不同的组织中其活性水平也不相同。AKP对辐射小鼠不同组织中及血浆中CAT活力的影响如表3所示,与正常对照组相比,辐射后模型组各脏器组织中CAT含量显著降低(p<0.05)。与模型组相比,利可君片组能够显著提高辐射小鼠心脏、脾脏、肾脏和血浆中CAT的水平(p<0.05),AKP低剂量组效果较好,能够使心脏、肾脏、血浆中CAT含量基本恢复到正常对照组水平,而中、高剂量组可能是由于AKP浓度过高,产生一定的副作用,或者机体间存在一定的个体差异,使得各组织中CAT水平相比于低剂量组有所下降,但是也优于辐射模型组,这表明一定剂量的AKP能够显著提高小鼠各脏器组织及血浆中CAT的活力,但在不同的组织中CAT提高的水平不一致,具有显著性的差异。

表3 AKP对辐射小鼠各组织及血浆中CAT活力的影响

注:各组织中CAT含量单位为U/mg prot;血浆中CAT含量单位为U/mL。

表4 AKP对小鼠各组织及血浆中GSH-Px活性的影响

注:各组织中GSH-Px含量单位为U/mg prot;血浆中GSH-Px含量单位为U/L。

表5 AKP对辐射小鼠各组织及血浆中GSH含量的影响

注:各组织和血浆中GSH含量单位为μmol/L。

2.2.4 AKP对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响 AKP对辐射小鼠各脏器组织和血浆中GSH-Px活力的影响如表4所示,与正常对照组相比,模型组中GSH-Px的活性显著降低(p<0.01),其中心脏中GSH-Px活性最低,这表明心脏受到的辐射损伤最严重。辐射前灌胃利可君片和不同剂量的AKP后,与模型组相比,各组织器官中GSH-Px的活力都有不同程度的升高(p<0.05),由于心脏受到的损伤最严重,修复也比较困难,因此,加药组虽然对GSH-Px的水平有一定的提高,但是相比正常对照组还具有显著性的差异(p<0.05)。而AKP中剂量组使肝脏、脾脏以及血浆中GSH-Px的含量得到很好的修复(p<0.05),AKP高剂量组效果相对较差,从总体上看,利可君片和中剂量AKP对保护GSH-Px的活性、提高机体抗辐射能力、预防氧化损伤起到很好的作用。

2.2.5 AKP对体内微量还原型谷胱甘肽(GSH)的影响 GSH是机体内最重要的非酶抗氧化剂,能够阻断自由基的链式反应,抑制脂质过氧化反应的发生,保护生物膜及生物大分子免受自由基的攻击,同时能够有效的保护由放射线、放射性药物以及某些抗癌药物引起的白细胞减少等症状[19]。AKP对辐射小鼠各组织及血浆中GSH含量的影响如表5所示,与正常对照组相比,辐射模型组小鼠各组织和血浆中GSH的水平显著降低(p<0.01)。与辐射模型组相比,长期灌胃AKP和利可君片增加了心脏、肝脏、脾脏、肾脏和血浆中GSH的含量(p<0.05),大约是辐射模型组的1.32～3.02倍,而中剂量AKP使心脏、脾脏和肾脏中GSH含量接近正常对照组的水平,GSH含量的增加能够有效提高机体的免疫力,保护机体组织免受伤害。这表明一定剂量的AKP和利可君片能够有效提高机体内GSH的水平,以提高机体抵抗氧化损伤的能力。

2.2.6 AKP对乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响 AKP对辐射小鼠各组织及血浆中LDH活力的影响如表6所示,与正常对照组相比,辐射模型组血浆中LDH的活性极显著升高(p<0.01),而各组织中LDH的水平出现一定程度的下降,这表明辐射使得机体的各组织器官受到损伤,使其膜的通透性降低,致使各器官组织中LDH大量外溢,释放到血液中,最终导致血浆中LDH大幅度升高。LDH释放率表明了机体损伤的严重程度,同时细胞代谢发生紊乱,导致恶性肿瘤因子的启动,癌症的发生率逐渐提高。辐射前灌胃利可君片和AKP后,能够提高小鼠不同组织中LDH的活性,随着AKP剂量的增加,低、中剂量AKP对机体各器官的保护作用增强,使得小鼠组织中的LDH活性也逐渐增加(p<0.05),尤其以中剂量效果最好,几乎达到了正常对照组水平。这表明AKP对机体的损伤有很好的防护作用,细胞膜受损程度较轻,各组织向外释放的LDH含量也逐渐降低,因此血浆中LDH的水平也逐渐降低,接近正常水平,即一定剂量的AKP能够保护细胞膜免受辐射造成的伤害,防止癌症等一系列疾病的发生。

表6 AKP对辐射小鼠各组织及血浆中LDH活力的影响

注:各组织中LDH含量单位为U/g prot;血浆中LDH含量单位为U/L。

3 结论

本实验研究了狗枣猕猴桃多酚的抗辐射作用,通过构建60Coγ射线辐射诱导的氧化损伤模型,进行体内抗氧化酶系表达的研究。与模型相比,AKP能够显著提高机体各脏器组织中SOD、CAT和GSH-Px等酶的活性,显著的降低机体内LDH以及MDA的含量,同时还能够促进体内抗氧化物质GSH的形成,提高机体的抗氧化能力,从而很好的保护机体免受辐射造成的氧化损伤。因此,狗枣猕猴桃多酚具有很好的辐射损伤防护作用,为其进一步应用于医药、保健食品提供了科学依据。

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The radioprotection ofActinidiakolomiktapolyphenols against organism damage by60Coγ-rays

ZUO Li-li1,FU Xiao-yi1,GAO Yong-xin1,SUN Mao-cheng1,WANG Zhen-yu2,WANG Shu-ran1,*

(1.School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin 132013,China; 2.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

In this paper selectedActinidiakolomiktaas raw material,to investigate radiation-protective effect ofActinidiakolomiktapolyphenols(AKP)by separation and purification. Male Kunming mice were divided into 6 groups randomly:control group,radiation model group,leucogen tablets group,low AKP group(50 mg/mg/kg·d),medium AKP group(100 mg/mg/kg·d),and high AKP group(200 mg/mg/kg·d). The interventions for AKP exposure continued for 14 consecutive days. Except contrast group,all 5 groups were irradiated by60Coγ-rays,the dose rate was 0.792 Gy/min,and radiation dose was 6.0 Gy. After radiation,analyze expression of antioxidant enzymes,MDA and GSH in mice. The results indicated that model mice significantly decreased in tissue SOD,CAT,GSH-Px and GSH content(p<0.05),increased MDA content(p<0.01),compared with control group. Middle dose group mice increased SOD activity(p<0.05),low dose group mice CAT activity returning to normal in heart,kidney,plasma,middle dose group mice GSH-Px activity significantly increased in liver,spleen,plasma(p<0.01),different doses group mice MDA content effectively reduce in tissue(p<0.05),middle dose group mice LDH activity returning to normal in tissue. But overall effect was not in competition with leucogen tablets. In conclusion,AKP could greatly protect the body,reduce the adverse effects of oxidative damage on organism,and to provide a scientific basis for further development and utilization.

Actinidiakolomikta;polyphenols;oxidative damage;radioprotection

2016-04-14

左丽丽(1982-)，女，博士，讲师，主要从事天然产物分离纯化、结构鉴定及其功能研究,E-mail：zuolili213@163.com。

*通讯作者:王舒然(1968-)，男，博士，教授，主要从事慢性病的膳食预防和控制,E-mail：shuranwang@163.com。

吉林市科技创新发展计划项目(20165016)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)22-0344-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.059