蒋林蓉,徐志伟,曾 敏,黄杰英,徐 莉,符传军,庞道标,李实飞

(海南出入境检验检疫局,海南海口 570311)



改进的QuEChERS结合RPLC-TMS测定水产品中生物胺的研究

蒋林蓉,徐志伟,曾 敏,黄杰英,徐 莉,符传军,庞道标,李实飞

(海南出入境检验检疫局,海南海口 570311)

采用改进的QuEChERS方法,利用液相色谱-串联质谱(RPLC-TMS)检测,建立了几种水产品中生物胺的分析方法。样品用乙腈+甲醇(9+1)提取,无水硫酸钠除去水分,经乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18混合粉末净化,采用HILIC柱,以乙腈/1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱进行液相色谱分离。质谱分析采用电喷雾正离子电离,多反应监测模式,外标法定量。结果显示6种生物胺在10～200 ng/mL范围线性关系良好。方法的定量限(LOQ,信噪比为10)为0.10 mg/kg。加标水平在0.10 mg/kg时,鱼、虾、蟹及鱿鱼四种阴性基质中加标的回收率在74.18%～90.15%之间,相对标准偏差(RSD,n=6)在2.22%～8.04%之间。结果表明本方法简便、快速、安全、适用于水产品中生物胺含量的定性和定量检测。

QuEChERS,液相色谱-串联质谱,生物胺,水产品,检测

生物胺是广泛存在于生物体及多种食品中的一类低分子量含氮有机化合物,根据分子结构的不同,生物胺可分为脂肪族(尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、胍丁胺等)、芳香族(酪胺、苯甲胺、苯乙胺等)和杂环类(组胺、色胺、5-羟色胺等)[1]。根据其结构组成中所含氨基(NH2-)的不同,还可以分为一元胺(组胺、色胺)和二元胺(如腐胺和尸胺)。大部分生物胺是氨基酸通过脱羧酶类催化脱羧形成的,也有部分是通过醛或酮的胺化和转胺作用形成的[1]。

水产品富含蛋白质,在加工和贮藏过程中会产生多肽和氨基酸,这些小分子物质容易进一步转化为生物胺。如鲐、鲣以及鲭鱼、鲱鱼、沙丁鱼、秋刀鱼、金枪鱼和竹鱼等,当鱼体不新鲜时可产生大量的生物胺(组胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺和亚精胺)[2]。

生物胺是激素、生物碱、核酸和蛋白质合成的前体物质,同时在人和动物的生物神经系统、循环系统、呼吸系统和消化系统、免疫系统及代谢过程的活性细胞中发挥着重要的生理作用[3]。适量的生物胺对人体健康是有益的,但在动物和人体内积聚达到一定量时就具有毒性[1]。我国规定鲐鱼类中组胺的限量标准为1000 mg/kg,其它海产鱼类为300 mg/kg(GB 2733-2005)。

生物胺分子中缺少发色基团,本身既无紫外吸收又无荧光及电化学活性,使得各类生物胺的分离及测定都比较困难。文献报道的测定生物胺的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、离子色谱法,毛细管电泳法(CE)等。已报道的HPLC法需要柱前或柱后衍生,操作繁琐且衍生条件苛刻,衍生产物不稳定,阳性样品无法确证,不适用于日常批量检测。QuEChERS(快速、简单、便宜、高效、可靠和安全)方法由Anastassiades等[4]于2003年提出。该方法具有快速、简单、便宜、高效、可靠和安全等特点,广泛应用于农药和兽药残留检测中样品的净化[5]。本研究采取改良的QuEChERS前处理方法,应用高效液相色谱-串联质谱同时检测6种生物胺含量。方法具有无需衍生、净化步骤简单、快速高效、灵敏度高等特点,为水产品质量安全监控提供了新的检测技术选择。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

尸胺盐酸盐(Cadaverine dihydrochloride,C5H14N2·2HCl)标准品、组胺盐酸盐(Histamine dihydrochloride,C5H9N3·2HCl)标准品、腐胺盐酸盐(Putrescine dihydrochloride,C4H12N2·2HCl)标准品、酪胺盐酸盐(Tyramine hydrochloride,C8H11NO·HCl)标准品、2-苯乙胺(2-Phenylethylamine,C8H11N)标准品 均购于Dr公司(纯度均>97.5%);色胺(Tryptamine,C10H12N2)标准品 购于TRC公司(纯度>95.0%);甲醇、乙腈(色谱纯) TEDIA公司;甲酸(色谱纯) MREDA公司；其他试剂 均为分析纯;实验用水 为一级水。

API-4000QTRAP质谱仪 美国AB公司;Agilent 1200液相色谱仪 美国安捷伦公司;320R离心机 德国Hettich公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的配制 6种生物胺标准储备液:分别称取6种生物胺标准品适量(精确到0.1 mg)于10 mL棕色容量瓶中,用适量水溶解并定容,得1 mg/mL标准储备液,于4 ℃避光保存,可使用6个月。

1.2.2 样品前处理 提取:称取2 g水产品样品(精确到0.001 g),置于离心管中,加入20.00 mL提取液(乙腈+甲醇(9+1)),涡旋混匀,加入无水硫酸钠5 g,涡旋混匀,4 ℃下以11000 r/min离心5 min,移取2 mL上清液供净化。

净化:移取2 mL上清液于加有100 mg PSA吸附剂和100 mg C18吸附剂的玻璃试管中,涡旋混匀1 min,4 ℃下以4000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm微孔滤膜,供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.2.3 仪器条件 色谱条件:Waters HILIC柱50 mm×2.1 mm,1.7 μm;流动相:乙腈-1%甲酸水溶液,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件:扫描方式:电喷雾正离子(ESI+)扫描;检测方式:多反应监测(MRM);辅助加热气:N2。气帘气压力(CUR):30.00 psi(N2);碰撞气压力(CAD):5.0 psi(N2);电喷雾电压(IS):5500 V;离子源温度(TEM):600 ℃;雾化气压力:55.00 psi(N2);辅助气压力:55.00 psi(N2);6种生物胺的定性离子对、定量离子等具体参数见表2。

表2 多反应监测扫描模式的质谱参数

注:*为定量离子。

1.3 数据处理

用乙腈/甲醇(9/1)溶液将标准储备液稀释得到不同浓度的混合标准工作溶液,按1.2.3所述方法测定。采用Analyst@1.5.3软件进行数据处理,以质量浓度为横坐标,定量离子对的峰面积为纵坐标建立标准曲线,外标法定量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确立

墨西哥竹子的利用可追溯到数千年前，其资源丰富且易于收获。在墨西哥温暖潮湿的气候条件下，竹屋或竹制庇护所方便建造且能够提供良好的居住环境，在整体特性上优于木屋(图7)。然而，在15世纪随着西班牙人的到来，新的建筑施工技术随之而来，殖民地建筑不仅在墨西哥而且在所有美洲国家大量使用。尽管竹子已经使用了数千年，但欧洲征服者认为竹材是次要材料或穷人的材料，而是采用其他建筑材料建设殖民地的基础设施。但是，土著居民仍然保持着利用竹子的传统。墨西哥竹利用发展的停滞与过去500年来欧洲人对土著居民的社会压制直接相关。

图1 几种生物胺的二级质谱图Fig.1 Two stage mass spectrometry of biogenic amines

在电喷雾正离子方式下对几种生物胺进行一级质谱分析(Q1扫描),得到分子离子,即母离子;对被测物的分子离子碰撞后,进行二级质谱分析,得到子离子质谱图,优化了碰撞能量。此外,还对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化。图1为几种生物胺的二级质谱图。图2为几种生物胺标准品多反应监测(MRM)色谱图。

图2 几种生物胺的标准品多反应监测(MRM)色谱图(10 ng/mL)Fig.2 Chromatograms of biogenic amines standard in MRM mode(10 ng/mL)

液相色谱-串联质谱分析结果表明,MRM模式中6种生物胺标准品的保留时间在4.49～7.33 min之间,溶剂峰干扰小,15 min内可完成对单个样品6种生物胺的定性和定量分析,适用于生物胺的日常检测。

2.2 提取溶剂的选择

有研究者认为生物胺检测分析中存在两个瓶颈:一是样品基质的复杂性,二是样品中生物胺实际浓度较低[6]。提取溶剂的选择会直接影响分析方法的回收率。崔晓美等[7]利用乙腈-乙酸胺溶液提取,亲水作用色谱法-串联质谱法测定鲣鱼中5种生物胺含量,在5～200 μg/mL范围内线性关系良好。孙亚军等[8]选取1%三氯乙酸(TCA)提取,HPLC-MS/MS测定虾仁中8种生物胺,该方法没有样品的净化过程,在大批量日常分析时可能会导致质谱中污染物残留而使质谱响应降低。

本实验分别使用乙腈、甲醇、水、1%甲酸乙腈、1%甲酸甲醇、乙腈+甲醇和乙腈+甲醇+甲酸进行提取。提取后的上清液经QuEChERS净化后通过RPLC-TMS检测。结果表明:采用纯乙腈进行提取,腐胺、尸胺等小分子二元胺,在PSA上有明显吸附,回收率过低;使用纯甲醇或含水溶剂提取,由于其强氢键作用,生物胺不会在PSA上吸附,但是许多杂质也不能在PSA上吸附,达不到净化效果;最终选取乙腈+甲醇为提取溶剂,不仅能够去除样品中的大部分杂质,还能获得较高的回收率。

进一步优化提取时乙腈/甲醇的比例,分别使用不同比例的乙腈+甲醇(95/5、9/1、1/1、1/9、5/95)溶剂进行实验。结果表明,随着提取溶剂中甲醇组分的提高,腐胺和尸胺的回收率迅速升高;但甲醇含量过高时,杂质含量也上升,样品的基质效应不断增强,影响分析的准确性。在甲醇含量为5%时,腐胺的回收率约为50%,尸胺回收率约为70%,其余生物胺回收率均大于80%;在甲醇含量为10%时,各生物胺回收率均可达到分析要求;在甲醇含量达到20%时,色胺开始出现明显的基质效应。综合以上实验结果,最终选择乙腈/甲醇(9/1)为提取溶剂。

2.3 净化条件的优化

Calbiani等[9]在软奶酪样品中生物胺的HPLC-MS/MS测定方法中,使用C18和腈基(CN)吸附剂,分别采用固相萃取小柱(SPE)和基质固相分散(MSPD)两种净化方法。结果发现MSPD净化法回收率更高。本研究尝试了强阳离子交换柱(MCX)、C18固相萃取柱、腈基基质固相分散萃取等净化方法。结果发现阴性基质中的样品加标的回收率过低，达不到分析要求。

QuEChERS方法将适量的净化剂直接作用于提取液中,尽可能多的吸附杂质的同时保留目标物,和普通的SPE相比少了淋洗、洗脱等步骤,相对普通SPE方法更为快捷和简便。乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂能够清除许多极性干扰成分,如脂肪酸、亲脂性色素和糖类等,但去除甾醇效果一般;C18吸附剂去除胆固醇、甾醇、色素的效果较好[10]。本研究选择在提取时采用改良的QuEChERS方法,使用无水硫酸钠除去水分,同时使用PSA和C18混合吸附剂,有效去除乙腈+甲醇提取液中的干扰杂质,具有良好的净化效果。

2.4 液相色谱柱和流动相的选择

生物胺属于小分子量的极性氨基酸,在反相色谱柱中不易保留。本研究尝试选择反相C18柱进行分离检测,实验发现6种生物胺的峰形较好,但有3种生物胺出峰时间均小于1 min,即使调节流动相组成和使用梯度洗脱保留时间也没有明显改善。丁涛等[11]利用C18柱,在流动相中加入0.1%七氟丁酸增大生物胺在反相色谱柱上的保留,结合高分辨质谱法分析葡萄酒中8种生物胺。七氟丁酸是离子对试剂,本研究前期实验发现流动相中的七氟丁酸组分虽然可以改善C18柱中几种生物胺的分离效果,但会对色谱柱填料造成不可修复的损伤,且会在质谱中长期吸附,导致其负离子模式响应大幅度降低。

HILIC色谱柱通过采用强极性固定相,并且结合高比例有机相∕低比例水相组成的流动相,能为强极性样品提供合适的保留时间[12]。吴云辉等[13]利用HILIC色谱柱,以5 mmol/L的乙酸铵溶液和甲醇为流动相对8种生物胺进行液相色谱-串联质谱分析,8种生物胺的出峰时间均小于1 min,容易有溶剂峰的干扰,影响测定方法的准确度。本实验选择HILIC色谱柱进行生物胺的色谱分离。结果表明,优化后的梯度洗脱条件(见表1),可较好地检测6种生物胺。

图3 鱼肉阴性样品加标的多反应监测(MRM)色谱图(10 ng/mL)Fig.3 Chromatograms of biogenic amines spiked in a negative fish sample(10 ng/mL)

在使用HILIC柱进行色谱分离时对流动相进一步优化,用乙腈/0.1%甲酸水(7/3)等度洗脱时,腐胺、尸胺、组胺峰形较好,但酪胺、2-苯乙胺、色胺在色谱柱上基本无保留;用乙腈/水或乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脱时腐胺、尸胺、组胺色谱峰过宽,拖尾严重。采用乙腈/1%甲酸水梯度洗脱时,6种生物胺的峰形、保留时间和响应值均较好。因此本研究选择HILIC柱进行分离,使用乙腈/1%甲酸水流动相梯度洗脱,可兼顾几种生物胺的质谱响应及色谱保留效果。

2.5 方法的线性关系及检出限

参照标准溶液配制成10～200 ng/mL的标准工作液,以质量浓度为横坐标,定量离子对的峰面积为纵坐标建立标准曲线,6种化合物在相应的质量浓度范围内线性关系良好,线性相关系数(r)均大于0.99。

表4 不同基质中生物胺的加标平均回收率与相对标准偏差(n=6)

方法,使用PSA和C18混合吸附剂净化除去杂质,结合RPLC-TMS分析,可实现水产品中6种生物胺的定量检测与确证。该方法净化效果好,准确度、精密度、定量限满足测定要求。可用于水产品中生物胺的快速筛查和定量分析。

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以10倍信噪比(S/N=10)所对应浓度作为方法定量限(LOQ),6种生物胺的定量限为0.10 mg/kg,线性实验结果和检出限见表3。

表3 6种生物胺的线性实验结果

2.6 方法的准确度和精密度

以鱼、虾、蟹和鱿鱼为代表基质进行了添加回收实验,添加水平为0.1 mg/kg,每个浓度设定6个重复实验。鱼肉阴性样品加标的多反应监测(MRM)色谱图见图3。6种生物胺在不同基质中的添加回收率及精密度见表4。几种生物胺的平均回收率在74.18%～90.15%之间。相对标准偏差(RSD)在2.22%～8.04%之间。

3 结论

采用乙腈+甲醇提取,利用改进的QuEChERS

Determination of biogenic amines in aquatic products by modified QuEChERS method and liquid chromatography-mass spectrometry

JIANG Lin-rong,XU Zhi-wei,ZENG Min,HUANG Jie-ying,XU Li,FU Chuan-jun,PANG Dao-biao,LI Shi-fei

(Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

A modified QuEChERS method followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis was developed for the determination of biogenic amines in aquatic products. The samples was diluted with acetonitrile/methanol solution(9/1)and cleaned up with primary secondary amine(PSA)and Octadecylsilane(C18)sorbent. The separation of biogenic amines was performed by hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)column and gradiently eluting with acetonitrile/formic acid-water(1%)without derivatization. Biogenic amines were analyzed by positive electrosprary ionization(ESI+)tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Quantification was achieved using external standard method. The linearities were excellent in the range of 10～200 ng/mL. The limits of quantification(LOQ,S/N=10)were 0.10 mg/kg. The recoveries of biogenic amines spiked in matrices were between 74.18% and 90.15% at the spiked levels of 0.10 mg/kg. The relative standard deviations(RSDs,n=6)were in the range of 2.22%～8.04%. The method(quick,easy,safe)could meet the requirements of the daily work for the determination of biogenic amines in aquatic products.

QuEChERS;RPLC-TMS;biogenic amines;aquatic products;determination

2016-05-27

蒋林蓉(1981-),女,博士,工程师,研究方向:食品中有毒有害物质检测,E-mail:jhping780524@163.com。

海南省自然科学基金项目(313105);海南省科技兴海项目(XH201407)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)22-0068-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.005