孔维健,常宇鑫,昝春芳,郑 爽，杨小玉

(吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春130041)

基于Cre-loxP系统条件性基因敲除小鼠的构建及其应用进展

孔维健,常宇鑫,昝春芳,郑 爽*，杨小玉*

(吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春130041)

随着科研技术水平的不断提高，转基因技术在基础实验研究中得到了广泛的应用，基因敲除技术是转基因技术中不可替代的组成部分，而条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术，与第一代基因敲除技术相比显然有着明显的优势和更为广泛的应用前景。其中基于Cre-loxP系统的条件性基因敲除小鼠因其良好的实验效果得到了许多研究的青睐，现已有多篇相关文献的成功报道。但Cre-loxP系统作为一项新技术，其相关原理及应用归纳尚不完善，在不同实验中构建Cre-loxP系统条件性基因敲除小鼠的具体方法也有所差异。本文以条件性基因敲除技术中典型的Cre-loxP系统为中心，通过查阅回顾相关文献，归纳出Cre-loxP系统的基本作用原理和应用该系统构建条件性基因敲除小鼠的一般方法，并对Cre-loxP系统构建的基因敲除小鼠在基础研究领域的应用加以分类，综述如下。

1 cre-loxp系统基本作用原理

1.1Cre重组酶(CyclizationRecombinationEnzyme)和loxP(locusofX-overP1)序列

Cre重组酶是大肠杆菌噬菌体P1中cre基因编码表达的由343个氨基酸组成的相对分子质量为38000的蛋白质[1]。它可以特异性识别细胞内基因或DNA上的loxP序列，并根据loxP序列的位置和loxP序列之间的关系介导不同的特异性重组反应。loxP序列是从大肠杆菌P1噬菌体中发现的长34 bp的碱基序列，由两个13bp的反向重复序列和中间8 bp的间隔序列组成。它是Cre重组酶的特异性识别结合位点，具体序列如下[2]：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′；3′-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5′。

1.2Cre-loxP系统的特性

Cre重组酶介导的两个loxP序列间的特异性重组根据序列位置和方向的不同分为三种情况：当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时，Cre重组酶能够敲除两个loxP序列间的DNA片段；当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相反时，Cre重组酶能够倒转两个loxP序列间的DNA片段；当两个loxP序列位于不同DNA链上时，Cre重组酶能够介导loxP序列间DNA链的交换或染色体易位[3]。在实验设计中实验者可以根据不同的研究需要选择相应的序列构建方式，来达到相应的目的。

2 条件性基因敲除小鼠的构建

应用Cre-loxP系统构建条件性基因敲除小鼠主要分为两个主要部分：构建具有loxP序列的目的基因突变小鼠和构建带有Cre酶基因的转基因Cre小鼠[4]。两种小鼠杂交后经筛选可得到细胞内同时存在Cre重组酶基因和loxP序列的小鼠，通过条件性表达Cre重组酶并与细胞内loxP序列特异性识别，删除相应的基因或基因片段，从而完成条件性基因敲除小鼠的构建。

2.1loxP突变小鼠的构建

通过查阅数据库，获取欲敲除目的基因或基因片段的相关序列信息，在基因的非编码区或编码区内含子中选择距离和长度适宜的两个区域插入loxP序列。在上游区域插入loxP序列，在下游区域插入loxP序列及正筛标记基因和负筛标记基因，构建出结构为“同源序列-loxP-目的基因或基因片段-正筛标记基因-loxP-同源序列-负筛标记基因”的DNA片段作为打靶载体[5]。将纯化后的打靶载体通过电穿孔、显微注射或病毒转染的方法注入小鼠胚胎干细胞中，得到携带loxP突变基因的靶细胞。三种技术各有其优劣：电穿孔法转化效率较高、操作较为简单，但其效率随质粒DNA片段长度和大小的增加而降低[6]；显微注射法技术较为成熟，DNA片段长度对转化效率影响较小，适用于长度较长的DNA片段，但技术相对复杂，转化效率低于电穿孔法和病毒转染[7]；病毒转染法效率高，特异性强，但对小鼠发育和健康有一定影响，且携带的外源基因片段长度一般较小，多不超过7 kb[8]。

根据同源重组，带有loxP序列的突变基因或突变基因片段将有部分整合到细胞的基因中。注入后通过正负筛选法筛选出导入打靶载体DNA片段的中靶细胞。应用显微注射法将中靶细胞注入小鼠囊胚内，将囊胚植入假孕小鼠子宫，发育得到带有loxP突变基因的嵌合体小鼠[9]。取小鼠尾部细胞培养，PCR扩增后通过DNA印迹法确认loxP突变基因已整合到小鼠染色体上。将嵌合体小鼠同野生型小鼠杂交，根据孟德尔遗传定律，有25%的几率得到带有突变基因的杂合突变小鼠，通过DNA印迹法筛选出带有突变基因的杂合突变小鼠。将杂合突变小鼠自交，得到两条染色体均带有loxP突变基因的纯合突变小鼠。

2.2转基因Cre小鼠的构建

Cre小鼠的构建基本原理与loxP突变小鼠基本一致。首先，根据实验研究目的选取特定的启动子，如lck启动子(胸腺细胞)[10]、晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)[11]、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大脑新皮质)[12]、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)[13]、aP2启动子(脂肪组织)[14]、AQP2启动子(肾脏集合管)[15]和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等，使Cre酶只在特定的组织器官和细胞中表达。以噬菌体P1的基因组为模板，设计引物扩增出Cre重组酶的基因片段，构建出带有Cre重组酶基因的DNA片段打靶载体，并根据需要引入外源性调控因子，如干扰素反应Mx1启动子[16]、他莫昔芬依赖的雌激素突变体启动子[17]和四环素调节系统[18]等。由外源性调控因子介导的基因敲除可以减少在实验动物胚胎发育早期由于关键基因功能异常所产生的副作用，从而实现时间上的特异性调控。将纯化后的打靶载体导入小鼠胚胎干细胞或受精卵中，筛选后得出中靶细胞，将中靶细胞导入假孕小鼠子宫，发育后得到带有Cre基因的杂合突变小鼠。

2.3基因敲除小鼠的构建

将杂合的转基因Cre突变小鼠同纯合loxP突变小鼠杂交，由于Cre重组酶表达后可以特异性识别DNA中的loxP位点并切除位点间的DNA片段，根据孟德尔遗传定律，小鼠出生后，经PCR鉴定将有50%的几率得到条件性基因敲除的杂合子小鼠F1；将F1代小鼠自交或与纯合loxP突变小鼠杂交，即可得到条件性基因敲除的纯合子小鼠F2，完成条件性基因敲除小鼠的构建。

3 Cre-loxP系统构建基因敲除小鼠的应用

3.1人类动物疾病模型的构建

人类疾病由于环境、基因等多方面因素的影响，其发生机制和影响因素都较为复杂，通过构建人类疾病的动物模型，可以更方便更有效的认识人类疾病的发生发展规律，研究疾病的相关防治措施并对措施的效果加以评价。通过特异性敲除疾病相关的目的基因，引起特定的蛋白或细胞因子缺失来构建出自发性动物疾病模型现在已得到越来越多人的认同。应用Cre-loxP系统可以实现在特定类型的组织或器官中特异性敲除目的基因，避免了某些与生长发育相关的基因敲除所导致的胚胎致死问题，在人类动物疾病模型的构建上有着明显优势，并有多篇文献的成功报道。例如利用Cre-loxP条件性敲除小鼠Osterix基因得到先天性脊柱侧凸小鼠模型，研究osterix基因在先天性脊柱侧凸发病中的作用，并应用所构建的模型探索先天性脊柱侧突的治疗方法[19]；通过条件性敲除p53/LKB1双基因构建出子宫内膜癌小鼠模型，研究子宫内膜癌的发生与发展[20]；应用Cre-loxP系统构建Alb-cre/DTR双转基因小鼠模型，并在此基础上建立可诱导型肝损伤模型，用于肝脏疾病的相关研究[21]等。这些研究均展现出了Cre-loxP系统条件性基因敲除小鼠在人类动物疾病模型构建中的良好效果。

3.2基因功能鉴定

为了研究某一特定基因在机体内的具体作用及功能，往往需要抑制该基因表达或敲除该目的基因，直接敲除目的基因与利用外界化学或生物条件抑制基因表达相比，其效果更明确具体，更能直观的反应基因的作用。如利用cre-loxP条件性基因敲除技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠，为进一步在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供了平台[22]；通过条件性敲除Rb基因，研究其在调控耳蜗支持细胞增殖中的作用及机制[23]；以及利用Cre-loxP特异性敲除Pdx1基因，通过检测Pdx1基因表达或缺失的胰岛细胞分化发育的情况，探讨Pdx1基因在胰岛素分泌细胞分化调控中的作用[24]等研究。在这些研究中通过利用Cre-loxP条件性基因敲除小鼠，构建出目的基因缺失的个体，通过与正常小鼠相比较，发现目的基因在个体生长发育中的具体作用。

3.3病毒发病机制及抗病毒免疫研究

基因敲除小鼠技术的发展使得科学家们对病毒宿主相互作用中病毒的发病原因及宿主抗病毒免疫机制有了更深刻的理解，例如，表达抗原特异性的、主要的组织相容性复合体(MHC)受限T细胞受体(TCR)的转基因小鼠模型已经被广泛用于研究病毒特异性T细胞反应[25]；而且由于小鼠对许多人类病毒缺乏易感性，通过制备具有人类病毒特异性受体的转基因小鼠来研究这些病毒的作用机制；科学家还可以通过敲除特定的基因或目标细胞群来研究在控制病毒感染中起决定性作用的免疫应答细胞和分子组分[26]。

4 Cre-loxP系统应用的优势与不足

Cre-loxP系统构建的条件性基因敲除小鼠现已广泛应用于免疫学、人类动物疾病模型复制及人类疾病发病机制、基因功能鉴定和表型研究等领域[27]。与完全基因敲除小鼠相比，条件性基因敲除小鼠具有时间和空间可控性，可以在特定药物、蛋白、激素或基因的作用下实现体内特定种类器官或组织中的基因敲除，避免了某些基因完全敲除所导致的胚胎致死效应，具有良好的应用价值。

Cre-loxP系统在理论上已十分成熟，但在实际应用中仍存在不足和限制。由于在Cre-loxP系统介导的条件性基因敲除小鼠的构建中需要通过同源重组将DNA片段整合到细胞基因组中，而细胞内发生非同源重组的几率远大于发生同源重组的概率，所以需要通过大量的筛选工作将发生同源重组的细胞选择出来，需要大量的时间和精力，影响了实验的效率；此外，Cre酶作为一种外源性重组酶，在哺乳动物中表达后具有一定的潜在毒性，Loonstra等人在2001年的研究显示，Cre酶会引起细胞增殖异常、DNA错配和染色体缺失等问题[28]；在体外载体构建的过程中虽然通过引入特定的启动子和增强子等操纵元件缩小了Cre酶在体内表达的部位和范围，但Cre酶仍在其他细胞中有少量表达，表达的Cre酶会引起其他细胞内的基因敲除和丢失，干扰实验效果[29]；最后，Cre重组酶特异性识别loxP序列并介导序列间的序列切除的过程是可逆的，其正向切除效率虽然高达70%-95%，但在目的器官或组织中仍有少量敲除基因未被敲除，这些未敲除的目的基因会在特定器官或组织内微量表达，继而对实验结果产生一定影响[30]。为了减少和降低由Cre-loxP系统自身带来的负面影响，可以通过对打靶载体进行修饰，例如引入其他位点特异性重组系统如Flp-frt、Dre-rox和φC31等来提高Cre酶表达特异性[31]，延长载体两端同源序列的长度来增加载体同源重组的几率等处理方法来提高实验构建效果。

5 总结

Cre-loxP系统作为一种特异性位点识别重组系统，有较为明确的技术原理，具有位点识别准确、特异性强、无需其他辅酶催化等优势。通过分别构建Cre转基因小鼠和loxP突变小鼠，在小鼠体内引入Cre重组酶基因，并在欲敲除的基因或基因片段两端引入loxP序列，通过杂交构建出体内同时含有Cre重组酶基因和loxP序列的条件性基因敲除小鼠。通过药物或激素等物质介导Cre酶重组酶在小鼠体内实现空间和时间上的特异性表达，识别特定组织或器官细胞内基因组上的loxP序列并敲除序列间的目的基因或目的基因片段，达到条件性基因敲除的目的。通过Cre-loxP构建条件性基因敲除小鼠，可以应用于人类动物疾病模型构建、基因功能鉴定、抗病毒免疫研究等诸多方面，具有良好的应用前景。

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国家自然科学基金(31572217)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2208-04

2017-03-11)