陈晨 张永宏

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550001;2.贵州医科大学附属医院消化内科，贵州 贵阳 550001)



△通信作者

带荧光标记的新型丙型肝炎病毒感染性克隆的构建及其活性鉴定

陈晨1张永宏2△

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550001;2.贵州医科大学附属医院消化内科，贵州 贵阳 550001)

丙型肝炎病毒; 绿色荧光蛋白; mCherry; Huh7.5肝癌细胞; 感染

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科丙型肝炎病毒属。研究[1]发现在HCV NS5A结构域Ⅲ中可插入大量异源序列如绿色荧光蛋白(EGFP)，从而对HCV感染的活细胞进行可视化研究。本次实验将探索利用新型全长HCV感染性克隆(包括HCV基因2a型，同时构建HCV基因5a型嵌合体)，建立带有报告基因EGFP、mCherry的HCV基因2a及5a型的活病毒，在完整HCV生命周期的水平上研究感染情况，为寻找HCV新药物提供治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌细胞系Huh7.5细胞、质粒PJ6/JFH1-NS5Adel40EGFP(J6/JFH1-EGFP),PJ6/JFH1-NS5Adel40 mCherry(J6/JFH1-mCherry),YL21-2PSA135’UTR-NS2/JFH1(YL21),YL11 PJ65’UTR-NS2/JFH1(YL11)均为广州中山大学病毒所提供。DMEM及新生牛血清购自美国 Gibco公司； T4-DNA 快速连接酶、NruI 内切酶购自美国NEB公司；SanDI、MreI等酶购自美国Fermentas公司；细胞转染用脂质体Lipofectamine 购自美国Invitrogen公司；其他常用试剂为广州中山大学实验室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 携带EGFP/mCherry报告基因质粒的构建 将目的基因J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry及载体YL21用SanDI和MreI双酶切，回收携带报告基因EGFP或mCherry的片段，以T4 DNA快速连接酶连接，以空载体作对照。连接产物转化至E.coli(Top10感受态),接种至LB(含氨苄AMP)平板，37 ℃孵箱过夜培养。

1.2.2 克隆鉴定及序列分析 挑取LB平板上生长的单个菌落至LB液体培养基，37 ℃，280 rpm,震摇培养16 h.取初筛阳性的菌株小量提取质粒，并用酶切以鉴定插入片断。获得新的带有荧光蛋白的YP12pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-EGFP(5a-EGFP)，YP13pSA135’UTR-NS2/JFH1-NS5Adel40-mCherry(5a-mCherry)。

1.2.3 质粒转染 Huh7.5肝癌细胞株用DMEM培养基,在37 ℃，5%CO2条件下接种于6孔板，3.5×105/孔细胞数，培养约20 h,待形成约90%细胞单层后,用Lipofectamine试剂盒转染J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry，5a-EGFP,5a-mCherry,YL11。操作过程按产品使用说明书进行。

1.2.4 EGFP/mCherry表达水平检测及病毒滴度测定 转染培养Huh7.5细胞在24 h、48 h、72 h、6 d、9 d、11 d、13 d直接在荧光显微镜下观察荧光细胞。同时在上述时间点取含HCV病毒的转染细胞培养上清液感染新的Huh7.5细胞，感染16 h更换DMEM培养基继续培养,24 h后通过荧光显微镜观察荧光细胞了解感染性病毒颗粒释放情况，通过计数被感染细胞的荧光灶点形成单位(FFU/mL)计算细胞培养液的病毒滴度。具体测定方法参照文献[2]报道进行。

2 结 果

2.1 阳性克隆酶切鉴定及序列测定 按照1.2.1设计进行酶切获得含有报告基因的目的条带。通过酶切鉴定克隆成功。并挑取阳性克隆进行序列分析，插入片段与模板DNA完全一样。

2.2 Huh7.5细胞荧光蛋白检测 如箭头所示见图1。

注:A1及A2，分别是J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry;B1 及B2，分别是5a-EGFP、5a-mCherry;表示上述各病毒用转染细胞 的培养上清液感染新的细胞后的荧光检测结果(荧光显微镜放大 倍数40倍)。图1 重组HCV RNA 感染后细胞荧光检测

2.3 病毒滴度测定 根据1.2.4的实验结果在病毒转染Huh7.5细胞后测定其不同培养天数的FFU值。见表1。

表1 带有EGFP/mCherry的重组体滴度测定结果

3 讨 论

本次实验研究主体是分别带有荧光蛋白标记的含EGFP或mCherry病毒。通过荧光蛋白作为荧光标记分子可以插入或是接合到目标基因并转染到细胞中的方法，并运用荧光显微镜成像实时监测其活病毒转染及感染到细胞的变化，被认为是一种极强的标记物。实验研究对象是2a及5a嵌合体基因型的HCV病毒。利用J6-JFH1嵌合体病毒，将编码荧光蛋白(GFP, RFP和VENUS-GFP)插入到NS5A区域，作为标记，即JC1/RFP,JC1/GFP,VENUS-JC1，JFH-EGFP。这些RNA在转染Huh7细胞后，可产生活病毒[3]，表明NS5A结构域Ⅲ允许插入外源基因，而不会严重损害病毒的复制[4]。本实验将带有EGFP/mCherry的质粒(J6/JFH1-EGFP,J6/JFH1-mCherry)分别插入到质粒YL21中，成功的克隆出5a嵌合体5a-EGFP和5a-mCherry。并转染到Huh7.5细胞中，荧光检测细胞内可见EGFP/mCherry的表达，用其细胞培养上清液能感染新的Huh7.5细胞。通过对以上活病毒的收集，完成病毒滴度测定。

本研究成功致力于携带有报告基因的HCV克隆构建，同时鉴定该类克隆的病毒活性，这为不同地区、不同人群HCV感染的自然史、临床检验、预后以及影响其转归的因素有哪些等一系列问题提供了新的指导思路。

[1] Appel N, Pietschmann T,Bartenschlager R.Mutational analysis of hepatitis C virus nonstructural protein 5A: potential role of differential phosphorylation in RNA replication and identification of a genetically flexible domain[J]. J Virol, 2005,79(5):3187-3194.

[2] Zhang J,Gastaminza P,Cheng G,et al.Robust hepatitis C vius infection in vitro[J].Proc Acad Sci USA,2005,102(26):9294-9299.

[3] Schaller T, Appel N, Koutsoudakis G,et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes[J]. J Virol, 2007,81(9):4591-4602.

[4] Gottwein JM,Jense TB,Mathiesen CK，et al. Development and Application of Hepatitis C Reporter Viruses with Genotype 1 to 7 Core-Nonstructural Protein 2 (NS2) Expressing Fluorescent Proteins or Luciferase in Modified JFH1 NS5A(2011)[J].J Virol,2011,85(17):4991-4996.

R512.6+3，R735.7

B

1000-744X(2016)03-0258-02

2015-10-18)