袁睿 刘莲 马建军 张力 刘红芸

CIK免疫疗法治疗HBV携带者疗效观察

袁睿 刘莲 马建军 张力 刘红芸

目的 观察针对HBV携带者，采用CIK免疫疗法进行治疗产生的临床疗效。方法选取60例HBV携带者，随机分为两组，治疗组与对照组各30例；给予对照组常规保肝治疗，治疗组则采取常规保肝治疗+CIK免疫疗法，对HBV携带者进行治疗；观察不良反应情况，并分别于治疗前后比较两组免疫反应、细胞因子变化情况。结果治疗组出现不良反应2例，概率6.67%；治疗前HBV-DNA载量、HBV-DNA阴转情况，2组差异无统计学意义(P>0.05)，治疗6个月后，HBV-DNA载量下降≥2个log值，共10例，有效率为33.3%，HBV-DNA阴转共6例，有效率为20%；对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；比较治疗前后细胞因子变化，对照组于治疗前后无差异(P>0.05)，治疗组IL-2、IFN-γ升高，IL-4、IL-10水平均降低，IFN-γ/IL-10升高，均存在统计学意义(P<0.05)；对照组于治疗组组间依次比较，治疗后指标均出现显著差异(P<0.05)。结论CIK免疫疗法治疗HBV携带者，可有效改善Th1/Th2细胞功能，促进HBV-DNA阴转，对治疗HBV具有重要作用，值得临床推广。

CIK；HBV携带者；HBV-DNA阴转；细胞因子

HBV乙型肝炎病毒为嗜肝DNA病毒，乙肝病毒在肝脏内繁殖和复制，但是对肝细胞没有明显的直接损伤，其引起慢性乙型肝炎的发病机制仍不清楚，可能与机体的免疫应答等有关。免疫耐受期和非活动型携带者的HBV感染者没有临床症状且肝功能正常[1]。由于HBV感染患者的自身免疫状态不同、被感染方式不同。且患者的病毒复制情况不同，患者发生肝外感染疾病情况有一定差异，导致慢性HBV携带者会出现不同情况的肝组织病变，病理有一定差异，甚至可直接发展为肝硬化或肝癌[2]，所以他们也需要临床早期干预。本研究中通过观察CIK免疫疗法治疗前后的外周血Th1相关因子白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和Th2相关因子白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)的浓度来了解Th1/Th2细胞功能，从而阐明免疫耐受在HBV携带者疾病进程中的作用机制，寻求打破免疫耐受可能的免疫治疗方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2013年1月至2013年11月门诊及住院治疗的患者共60例，所有患者诊断均符合2010年慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准[3]，且无甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎等重叠感染，无酒精及药物导致的肝脏损伤。纳入患者既往无抗病毒药物治疗病史和免疫调节药物治疗病史，并均知情同意，签署同意书。对患者随机分为治疗组及对照组，治疗组30例，男16例,女14例；年龄19～57岁,平均(37.4±2.6)岁；对照组30例，男15例,女15例，年龄20～54岁,平均(35.8±2.4)岁。2组临床资料，其性别比、年龄，以及病毒学指标等相似，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 2组HBV携带者均给予常规的保肝等治疗，而治疗组则在对照组治疗的基础上，另为患者给予CIK免疫疗法，留取患者血清，使用ELISA法检测细胞因子IL-2、IFN-r、IL-4、IL-10，对治疗组进行CIK治疗。

1.2.1 CIK细胞体外扩增：所有治疗组患者在治疗前均进行采血。使用血细胞分离机封闭式挂到对单个核心给予采集，在无血清培养基AIMV将细胞数量调整为1×106个/ml，治疗首日加入rhIFN-γ 106U/L，在培养1d后加入rhlL-2(剂量为3×105U/L)，rhIL-1 (剂量为3×105U/L)及OKT(剂量为350 μg/L)进行继续培养。每四天更换一次培养基，将细胞数量调整为1×109个/L，随后再补加rhlL-2，剂量为3×105U/L。随后每8 h再补加rhIL-2及OKT 350 μg/L。2周后对CIK细胞进行收集，使用0.9%氯化钠溶液进行3次洗涤，并加入人血白蛋白。使用0.9%氯化钠溶液配成100 ml细胞悬液，并进行静脉回输，每日输入1次，共输入3 d，每次细胞数量为2×106～6×106个。在回输前要确保支原体检测、细菌检测及病毒检测均呈现阴性。

1.2.2 仪器与主要试剂：Human THl/TH2 Cytokine Kit(BD公司)；无血培养基(AIMV)(G1BCO提供)；Forma311型C0：培养箱，Formal205生物安全柜。XL型流式细胞仪为COUL—TER公司生产，血细胞分离仪(CS-3000PLUS)。

1.3 观察指标 对患者输液期间不良反应进行观察和统计，利用WH0统一标准给予评价毒性[4]。对患者给予治疗前治疗后免疫指标进行测定，方法为流式细胞仪检测，其中Th1细胞选择IL-2和IFN-γ因子，Th2细胞选择IL-4和IL-10作为代表，并检测健康者的免疫指标。

2 结果

2.1 临床观察 CIK细胞回输后，治疗组食欲、精神、较前改善者共28例，仅2例患者在回输时发生了不良反应(占6.67%)，表现为面部潮红伴轻微烦躁感，患者均无发热、皮疹等不良反应；所有患者回输后均给予血常规、肝肾功能的测定，均较治疗前无明显改变。

2.2 2组免疫反应对比 治疗前，2组HBV-DNA载量、HBV-DNA阴转情况比较，组间无统计学差异(P>0.05)；治疗后6个月，治疗组30例患者经CIK免疫治疗，10例患者HBV-DNA较治疗前下降大于等于2个

log值，显效率为20%，有效率为33.3%；2组HBV-DNA载量比较，于治疗后6个月，治疗组改善显著，差异存在统计学意义(P<0.05)；治疗组有6例患者出现HBV-DNA阴转，有效率为20%；对照组无阴转，有效率为0，统计学差异显著(P<0.01)。见表1。

组别HBV-DNA载量(log)治疗前治疗后HBV-DNA阴转[例(%)]治疗前治疗后治疗组7.42±0.674.32±0.64*06(20.0)*对照组7.39±0.717.36±0.5800t值0.4759.3840.00027.358P值>0.05<0.05>0.05<0.01

注：与治疗前比较，*P<0.05

2.3 治疗前后细胞因子的变化 治疗组：IL-2和IFN-r较治疗前升高，IL-4和IL-10水平均较治疗前降低，IFN-γ/IL-10较治疗前升高，各指标较治疗前存在统计学意义(P<0.05)。对照组，以上4项指标治疗后与治疗前无显著差异(P>0.05)；2组依次比较，治疗前指标无差异(P>0.05)，治疗后指标均出现显著差异，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别IL-2治疗前治疗后IFN-γ治疗前治疗后IL-4治疗前治疗后IL-10治疗前治疗后治疗组119.64±52.71181.23±73.87*16.07±10.4729.07±14.38*97.54±44.7351.72±38.47*37.25±11.5418.27±7.84*对照组118.81±53.45121.49±60.7315.73±9.8716.76±11.7298.17±43.8796.54±41.8637.34±10.9735.41±9.93t值0.01514.3580.27216.2460.13516.5741.02413.257P值>0.05<0.01>0.05<0.01>0.05<0.01>0.05<0.01

注：与治疗前比较，*P<0.05

3 讨论

CD4+Th细胞按照所产生细胞因子的不同，包括有Th1和Th2[5]。其中Th1型细胞主要介导人体内的细胞免疫应答，且会产生IFN-γ、IL-2、IFN-α等；而Th2型细胞则可以促进人体内的抗体的产生，并会有效地介导体内的体液免疫应答反应，产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。临床大量研究显示[6]， IFN-γ和IL-2为Th1型细胞因子代表， IL-4、IL-10则为Th2型细胞因子的代表。因此当患者体内出现有Th1/Th2的失衡，可以利用IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-2等进行表示。

目前临床研究认为，慢性乙型肝炎患者伴有Th2细胞所介导的体液免疫反应，并以其为主导作用，而IFN-γ则可以对乙型肝炎病毒感染产生免疫调节。乙型肝炎病毒在体内转录后，其水平会受到抑制，而IFN-γ结合可以与细胞受体相结合，并进一步产生抗病毒蛋白。在Th1型细胞中，随着Th2细胞合成的增加，会受到一定的限制，并导致IFN-γ对乙型肝炎病毒的杀灭作用减弱，使人体对病毒的抑制作用降低，乙型肝炎病毒持续复制，导致慢性病的发生。

此外临床研究还显示出[7,8]，慢性乙型肝炎患者Th1细胞因子中的IFN-γ一般检测结果较低，提示我们患者的细胞免疫低下，且不能有效地对体内乙肝病毒进行清除。而IL-10则主要为单核细胞产生，可以对Th1细胞形成抑制作用，且IL-10还可以参与到乙肝免疫应答及肝脏炎性反应。研究发现，在慢性乙型肝炎患者中，IL-10与乙型肝炎DNA水平和ALT水平均有明显的相关性。从研究结果还显示出，治疗组进行CIK免疫治疗后能够有效地提高患者血清IFN-γ，并降低IL-10水平和升高IFN-γ/IL-10，并且治疗组在治疗后与治疗前有明显差异[9]。

在本研究中，通过CIK细胞体外扩增体外后回输，增强患者的免疫应答能力，抑制乙肝病毒在体内的复制。结果显示，治疗组30例患者经CIK免疫治疗，10例患者HBV-DNA较治疗前下降大于等于2个log值，显效率为20%，有效率为33.3%；2组HBV-DNA载量比较，于治疗后6个月，治疗组改善显著，差异存在统计学意义(P<0.05)；治疗组有6例患者出现HBV-DNA阴转，有效率为20%；对照组无阴转，有效率为0，统计学差异显著(P<0.01)。治疗组：IL-2和IFN-γ较治疗前升高，IL-4和IL-10水平均较治疗前降低，IFN-γ/IL-10较治疗前升高，各指标较治疗前存在统计学意义(P<0.05)。进一步说明了通过CIK免疫疗法对HBV携带者有较好的治疗效果，可以提高临床治疗效果。

1 中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南2010年版更新版.中华实验和临床感染病杂志:电子版,2011,5:50-60.

2 欧阳录明,陈福春,胡永轩,等.HBV感染者免疫调节细胞因子表达变化的研究.中国医药导报,2012,9:69-70.

3 Hontscha C,Borck Y,Zhou H et al.Clinical trials on CIK cells: first report of the international registry on CIK cells (IRCC).Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2011,137:305-310.

4 贾文玲,王凤梅,丁会莲等.替比夫定联合抗HBV特异性主动免疫疗法治疗慢性HBV携带者临床观察.甘肃医药,2012,31:35-36.

5 周兵,柏正平.阿德福韦酯联合免疫疗法和扶正祛邪中药治疗YMDD变异慢性乙型肝炎的疗效.中外健康文摘,2012,9:145-146.

6 范公忍,赵满仓,魏文清,等.乙型肝炎病毒感染者外周血T淋巴细胞亚群表达与其血清HBV-DNA水平的相关性分析.标记免疫分析与临床，2011,18:294-297.

7 Ma YJ,He M,Han JA,et al.A clinical study of HBsAg-activated dendritic cells and cytokine-induced killer cells during the treatment for chronic hepatitis B.Scandinavian Journal of Immunology,2013,78:387-393.

8 马艳玲,赵培利,杨丽敏,等.抗HBV特异性主动免疫疗法治疗慢性乙肝病毒携带者3年随访研究.中国保健营养,2015,25:37,40.

9 马发芝.主动免疫联合清肝片治疗慢性乙肝病毒携带者.当代医学,2010,16:146-147.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.025

050031 河北省石家庄市裕强街道办事处社区卫生服务中心(袁睿、刘红芸)；河北省石家庄市第五医院(刘莲、马建军)；河北省赵县人民医院(张力)

R 512.62

A

1002-7386(2016)24-3771-03

2016-07-02)