刘云云 王保军 齐战

肺鳞癌和腺癌中E-钙黏附素和基质金属蛋白酶-9的病理意义

刘云云 王保军 齐战

目的 检测肺癌组织中E-钙黏附素(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-9( matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达，并对两者与临床病理特征的关系进行了研究。方法应用免疫组织化学方法，对138例肺鳞癌和肺腺癌以及对应的癌旁正常肺组织中E-cadherin和MMP-9蛋白的表达情况进行了检测。结果肺癌组织中E-cadherin的阳性表达率为28.99% (40/138)，正常肺组织为66.67%(92/138)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；在肺癌组织中，MMP-9的阳性表达率为59.42% (82/138)，正常肺组织为29.71%(41/138) ，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；E-cadherin和MMP-9的表达水平均与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存时间有明显相关(P<0.05)；两者的表达与病理类型、性别、年龄、吸烟史无关(P>0.05)；E-cadherin蛋白的表达与MMP-9蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。结论E-cadherin低表达与MMP-9高表达是肺癌侵袭转移的重要生物学指标。

肺癌；E-cadherin; MMP-9; 侵袭转移

肺癌是目前世界上发病率及病死率最高的肺部原发性恶性肿瘤，很多患者就诊时已发生了局部浸润和远处转移。上皮间质转化以及基底膜的降解被认为是肿瘤发生浸润转移的关键环节，通过上皮间质转化，上皮细胞失去了细胞极性以及与基底膜的连接，从而获得了较高的迁移与侵袭力以及抗凋亡和降解细胞外基质的能力。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞，通过特定的程序，转化为具有间质表型的细胞，并获得了迁移力和侵袭力的重要生物学过程[1]。EMT与胚胎发育和组织重建有关，在慢性炎症性疾病、多种纤维化性疾病以及癌症转移过程中发挥了重要作用。近年来，趋化吸引理论逐渐成为肿瘤研究的热点，肿瘤细胞表达的趋化因子受体与和靶器官表达的趋化因子共同作用，促进了肿瘤细胞的移动。在这一病理过程中，细胞黏附分子E-钙黏附素(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)起着重要的作用。E-cadherin是钙依赖性细胞黏附分子，是一种介导细胞间粘附的跨膜糖蛋白，主要表达于上皮细胞膜，维持上皮细胞的形态、极性以及组织结构的完整性，E-cadherin的表达减少或缺失可使细胞间黏附功能降低，是EMT事件发生的重要环节。MMP-9具有降解细胞外基质和基底膜以及促进肿瘤新生血管生成的作用，MMP-9表达上调可导致肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移。本研究利用免疫组织化学染色方法，通过检测肺鳞癌和肺腺癌以及癌旁正常肺组织中E-cadherin和MMP-9的表达，进一步探讨两者与肺癌临床病理特征以及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年12月至2013年12月河北医科大学第四医院胸外科收治的138例肺癌患者的临床资料，手术前未接受放化疗，取相应的癌旁正常肺组织138例作为对照。所有组织标本均经甲醛固定和石蜡包埋，病理组织学明确诊断为肺鳞癌和肺腺癌。其中肺鳞癌91例，肺腺癌47例；男86例，女52例；年龄31～78岁，平均年龄(62.3±7.1)岁；高分化癌48例，中分化癌47例，低分化癌43例；有吸烟史74例，无吸烟史64例；伴有淋巴结转移58例，无淋巴结转移80例。采用IASLC/UICC公布的第七版TNM肺癌分期标准(2009年)，Ⅰ期 41例(Ⅰa19例，Ⅰb22例)，Ⅱ期39 例(Ⅱa 20例，Ⅱb19 例)，Ⅲ期58例(Ⅲa33例，Ⅲb25例)。

1.2 方法 免疫组织化学染色法 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(streptavidin-perioxidase，S-P法)进行免疫组化检测。组织标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm的切片，经脱蜡、脱苯及水化后，3%双氧水去除细胞内源性过氧化物酶活性，高温高压进行抗原修复，5%正常山羊血清封闭后，然后依次滴加一抗E-cadherin抗体和MMP-9抗体 (美国Santa Cruz公司)、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，DAB显色，苏木素染核后，树脂封片。

1.3 结果判定 E-cadherin蛋白和MMP-9 蛋白主要表达于细胞质中，以细胞质出现棕黄色颗粒染色为阳性。由2位有经验的病理科医师对细胞染色强度和阳性细胞比例进行评分。按细胞染色强度评分：无染色为0分，淡黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，棕褐色染色为3分；按阳性肿瘤细胞所占比例评分：无细胞染色为0分， <25%细胞染色为1分，25%～50%细胞染色为2分，50%～75%细胞染色为3分，≥75%为4分。两项评分乘积作为总积分：0为阴性(-)；1为弱阳性(+)；2～4为阳性(++)；6～9为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件,计数资料用率表示，采用χ2检验，采用Spearman等级相关分析进行相关性研究，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-cadherin和MMP-9在肺癌组织及癌旁肺组织中的表达 在肺癌组织及癌旁肺组织中，E-cadherin的阳性表达率分别为28.99%(40/138)和66.67%(92/138)，差异有统计学意义(P<0.05)；MMP-9的阳性表达率分别为59.42%(82/138)和29.49%(41/138)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1。

图1 E-cadherin在肺癌组织中的阳性表达(免疫组化×200)

图2 MMP-9在肺癌组织中的阳性表达(免疫组化×200)

表1 肺癌、癌旁正常肺组织中 E-cadherin与MMP-9蛋白表达结果 n=138，例

2.2 E-cadherin、MMP-9蛋白的表达与肺癌患者临床病理特征的关系 E-cadherin蛋白的阳性表达率与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存时间有关(P<0.05)。分化程度越低、TNM分期越晚、伴有淋巴结转移以及术后生存时间越短者，E-cadherin蛋白的阳性表达率越低；MMP-9蛋白的阳性表达率亦与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存时间有关(P<0.05)。分化程度越低、TNM分期越晚、伴有淋巴结转移以及术后生存时间越短者，MMP-9蛋白的阳性表达率则越高。在肺鳞癌和肺腺癌中，E-cadherin蛋白和MMP-9蛋白的阳性表达率无统计学意义(P>0.05)。E-cadherin蛋白和MMP-9蛋白的阳性表达率均与患者的性别、年龄、吸烟史以及肿瘤瘤体大小无显著性相关(P>0.05)。见表2。

表2 肺癌组织中E-cadherin和MMP-9阳性表达与临床病理特征的关系 例

2.3 E-cadherin和MMP-9表达的相关性 Spearman等级相关性分析显示，在肺鳞癌和肺腺癌组织中，E-cadherin蛋白的阳性表达率和MMP-9蛋白的阳性表达率呈显著负相关关系(r=-5.753，P=0.016)。见表3。

表3 肺癌中E-cadherin与MMP-9表达的相关性 例

3 讨论

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在世界范围内，每年因肺癌死亡的人数超过100万人。肺癌根据临床和组织病理学特征，大致分为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small lung cancer,SCLC)两种类型，其中NSCLC约占肺癌总数的80%～85%[2]，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，其中，肺腺癌占NSCLC总数的50% 以上，是最常见的组织亚型，肺鳞状细胞癌在NSCLC中排名第二，大约占20%～30%。治疗方案主要有手术、放化疗以及靶向药物治疗，在所有NSCLC患者中，约75%的患者在就诊时已是局部晚期或有远处转移，仅有一小部分患者可以通过积极的治疗得以治愈。在肿瘤的侵袭转移过程中，上皮间充质转化扮演着重要角色。EMT是肺癌发生侵袭转移的主要方式之一，这种表型变化还可诱导E-cadherin表达的转录因子水平升高，并且被认为参与了一些致癌信号通路。E-cadherin是一类钙依赖性跨膜糖蛋白，广泛分布于人体组织的上皮细胞内，具有促使细胞与细胞间相互黏附，从而保持密切接触的功能，阻止瘤细胞脱离原发灶，进一步防止瘤细胞进入周围组织和脉管系统形成转移瘤；相反，敲除掉转基因小鼠模型中的E-cadherin，结果显示E-cadherin低表达，并可诱导EMT的发生。E-cadherin的表达可以在转录、翻译、翻译后蛋白降解等多水平进行调节。EMT是肿瘤发生浸润转移的关键步骤，E-cadherin表达减少和(或)缺失是上皮-间质转化发生的标志性特征。因此，E-cadherin被认为是一种重要的抑癌基因。多项研究表明，E-cadherin在多种肿瘤组织中如甲状腺癌[3]、胰腺癌[4]、结直肠癌[5]、胃癌[6,7]、乳腺癌[8]中表达下降。

本研究结果显示，在肺癌中，E-cadherin 的阳性表达率为28.99%，明显低于癌旁正常肺组织中的66.67%，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明E-cadherin表达下调在肺癌的发生中扮演着重要角色。E-cadherin的表达与病理类型无关，在肺鳞癌和腺癌中，其阳性表达率无显著性差异。E-cadherin的表达与肺癌的分化程度有关，肺癌分化程度越高，E-cadherin的阳性表达率越高，肺癌分化程度越低，E-cadherin的阳性表达率越低，表明E-cadherin 的表达水平是肺癌分化的重要标志。E-cadherin与肺癌的临床分期有关，分期越晚，表达水平越低；E-cadherin与淋巴结转移有关，发生淋巴结转移者，其表达水平下调；E-cadherin还与患者术后生存期有关，生存期≤2年者，E-cadherin的表达水平下降。提示E-cadherin表达下调和(或)缺失，造成瘤细胞间黏附性降低，瘤细胞脱离原发肿瘤灶，获得了在体内扩散的能力，使癌细胞发生侵袭转移成为可能。

肿瘤的侵袭转移是多因素、多阶段、多步骤的肿瘤细胞与宿主细胞间相互作用的复杂病理过程，其中包括：原发灶瘤细胞脱离，穿透基底膜，浸润周围间质，侵入局部毛细血管或淋巴管，小瘤栓在血液或淋巴液中运输，到达靶器官后粘附于内皮细胞，进一步浸润血管和基底膜，在周围间质不断增殖形成转移瘤。细胞外基质的主要组成成分是胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖以及蛋白多糖等，是防止肿瘤侵袭转移的重要屏障。在细胞外基质的降解过程中，瘤细胞分泌蛋白水解酶降解细胞外基质和基底膜，是肿瘤侵袭正常组织和开始转移的信号及重要途径，是发生浸润转移的关键环节。其中基质金属蛋白酶MMPs在这一过程中发挥了十分重要的作用。MMPs是降解细胞外基质的最重要的蛋白水解酶，目前对MMPs的研究是肿瘤侵袭转移研究的热点之一。多项研究表明，高转移和复发率、残留的肿瘤细胞以及肿瘤细胞的繁衍与MMD-9的表达有明显相关[9,10]。

MMP-9是一种结构中含有Zn2+肽链内切酶基因家族成员之一，属于基质金属蛋白酶的一种。MMP-9基因定位于染色体20q11.1～13.1，由13个外显子和9个内含子组成，分子量为26～27 kbp，MMP-9催化区的纤维连接蛋白结构域与明胶或弹性蛋白有高度的亲和力。MMP-9 含有的V型胶原蛋白结构域有高度的糖基化作用，可影响底物的特异性，以及具有抗衰变作用。MMP-9作用底物包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等。MMP-9是一种炎症细胞来源的调节因子，能特异性降解基底膜和细胞外基质、重塑细胞外基质的动态平衡。MMP-9还具有抑制肿瘤细胞凋亡以及释放血管内皮生长因子(VEGF)的功能，通过肿瘤血管的新生，使肿瘤细胞的浸润和转移成为可能。研究发现，MMP-9在肝癌[11]、胃癌[12,13]、乳腺癌[14,15]、前列腺癌[16]等多种肿瘤组织中表达下降。

本研究结果显示，在肺癌中，MMP-9的阳性表达率为59.42%，明显高于正常肺组织的29.49%。MMP-9蛋白在肺鳞癌和腺癌中的阳性表达率无明显差异，两者比较，无统计学意义，表明MMP-9与肺癌的病理类型无关。在低分化肺癌中，MMP-9的阳性表达率高于中分化和高分化肺癌；临床分期越晚，MMP-9蛋白的表达水平越高；伴有淋巴结转移者，MMP-9蛋白的表达水平增高；生存期<2年者，MMP-9蛋白的表达水平高于生存期≥2年者，提示在肺癌的侵袭转移过程中，MMP-9蛋白表达上调发挥了重要作用。

EMT是一个重要的生物学过程，对于胚胎的发生和器官的发育有着非常重要的意义。上皮细胞是由高度有序、形态均一的单层细胞组成，上皮细胞彼此之间紧密附着，而间充质细胞则形态各异，表现出更多的迁移和侵袭能力。上皮间充质转化使良性肿瘤发展成转移性肿瘤，进而侵袭其它器官组织。多项研究发现，MMP-9蛋白表达上调，E-cadherin蛋白表达下调，可诱发上皮-间质转化，进而促进肿瘤侵袭转移的发生，因此，MMP-9/E-cadherin 与EMT过程密切相关[17-19]。本研究通过对MMP-9及E-cadherin蛋白表达进行相关性分析，发现二者存在显著负相关，说明两者在EMT过程及肺癌的发生发展中发挥着不同的作用。

近年来，随着分子生物学的发展，对于肿瘤病因学的研究有了很大的进展，但是肿瘤的发生是一个多基因、多因素相互作用的异常复杂的过程。肿瘤是一种基因病，是瘤细胞单克隆性扩增的结果。环境和遗传的致癌因素，造成原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，促使细胞发生恶性转化，因此，肿瘤的发生是多种基因突变长期积累的结果。在这一过程中，机体的免疫监视系统能识别并及时清除突变细胞，从而防止肿瘤的发生，因此，肿瘤的发生是免疫监视功能丧失的结果。本研究发现MMP-9及E-cadherin 在肺癌侵袭转移过程中均起着非常重要的作用，MMP-9 及E-cadherin 的相互调控机制尚需要进一步深入探讨。对二者进行联合检测，可为肺癌的临床诊断、治疗、预后、监测提供科学的理论依据。

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Expression and clinical significance of E-cadherin and MMP-9 in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma

LIUYunyun*,WANGBaojun*,QIZhan.

*DepartmentofInternalMedicine,LinxiCountyPeople’sHospital,Hebei,Linxi054901,China

Objective To observe the expressions of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in lung cancer tissues,and to analyze the correlation between their expressions and clinicopathological characteristics of lung cancer.Methods The expression levels of E-cadherin and MMP-9 proteins were detected by immunohistochemistry (SP) in 138 cases of lung squamous carcinoma and lung adenocarcinoma as well as adjacent normal lung tissues.Results The positive expression rate of E-cadherin in lung cancer tissues was 28.99% (40/138),however,which was 66.67% (92/138) in normal lung tissues,there was a significant difference between them (P<0.05). The positive expression rate of MMP-9 in lung cancer tissues was 59.42% (82/138),however,which was 29.71% (41/138) in normal lung tissues,there was a significant difference between them (P<0.05). The expression levels of E-cadherin and MMP-9 were closely correlated to the differentiation degree,TNM staging of lung cancer, lymph node metastasis of lung cancer and patient's survival time after surgery (P<0.05), however, the expression levels of E-cadherin and MMP-9 were not related with pathological type of lung cancer,patient’s sex and age, smoking history (P>0.05).Moreover the expression of E-cadherin was negatively correlated to that of MMP-9 (P<0.05).Conclusion The low expression of E-cadherin and high expression of MMP-9 may be important biological indexes of invasion and metastasis of lung cancer.

lung cancer；E-cadherin; MMP-9；invasive metastasis

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.002

054901 河北省临西县第二人民医院内科(刘云云、王保军);河北医科大学第四医院胸外科(齐战)

齐战，050011 石家庄市，河北医科大学第四医院胸外科；

E-mail：qizhan@sina.com

R 734.2

A

1002-7386(2016)24-3690-05

2016-08-09)