李萍，樊毅，毛汐语，殷玥，赵军，徐志文，2，朱玲，2

（1.四川农业大学动物医学院动物生物技术中心，四川成都611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都611130）

猪链球菌感染病原的分离鉴定及药敏试验

李萍1，樊毅1，毛汐语1，殷玥1，赵军1，徐志文1，2，朱玲1，2

（1.四川农业大学动物医学院动物生物技术中心，四川成都611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都611130）

2016年3月，四川省南充市某规模化养猪场仔猪出现被毛粗乱、眼睑水肿、关节肿大、呼吸困难等症状，随即大量死亡。剖检可见心包腔积液，肝脏表面有大量白色纤维素性渗出物，并与胸膜、腹膜粘连。使用氟苯尼考、恩诺沙星治疗无效。根据临床症状、剖检病理变化及抗生素使用情况可初步判断主要病原为猪链球菌。无菌采集心包积液、关节积液、肺脏及脾脏进行细菌的分离鉴定，并将分离菌株进行常规抗生素药物敏感性试验以指导猪场科学用药，有效控制疫情。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无菌采集疑似感染猪链球菌的病猪心包积液、关节积液、肺脏及脾脏。

1.2 试验试剂和试验动物

主要培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）等购自青岛日水生物技术有限公司，兔鲜血琼脂培养基自行配制。

生化试剂微量发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、菊糖、棉籽糖、水杨苷、明胶、吲哚、枸橼酸钠等均购自杭州微生物试剂有限公司。

药敏纸片：氟苯尼考、恩诺沙星、强力霉素、丁胺卡那霉素、四环素、林可霉素、环丙氟哌酸、阿莫西林、苯唑西林、氨苄西林、头孢噻肟及头孢氨苄共12种药敏纸片（直径6 mm），均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

试验动物：20 g/只健康小鼠，购自四川农业大学。

1.3 直接染色镜检

取病猪的肺、脾、心包积液及关节积液进行革兰氏染色，镜检。

1.4 细菌的分离培养

用燃烧的酒精棉球将送检病料进行表面消毒，将剪刀和镊子消毒冷却后剪取病料病变与健康区域交界处的深层组织，划线接种于兔鲜血琼脂培养基及TSA培养基，置37℃恒温箱中培养24～36 h。观察菌落形态，挑取单个针尖大小、半透明且边缘整齐的菌落划线接种于TSA培养基进行分离纯化培养，置37℃恒温箱中培养12～24 h后，置4℃保存，待鉴定。

1.5 细菌的鉴定

1.5.1 细菌形态观察将上述纯培养物进行革兰氏染色，通过染色镜检，对可疑菌进行初步判断。

1.5.2 生化鉴定挑取纯培养物的单个菌落，分别接种于蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖等生化微量发酵管中，培养24～48 h后观察结果。

1.5.3 核酸检测将分离得到的可疑菌用16S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后将PCR产物送往上海生工公司测序。将测得序列与GenBank数据库中已发表菌株序列进行比对，从核酸角度对病原做出最终诊断，并分析其与不同菌株的同源性。

1.6 生物学特性测定

1.6.1 致病性试验将细菌纯培养物挑取单个菌落接种到TSB肉汤中，37℃恒温培养8～12 h。取菌液按0.2 mL/只剂量腹腔注射接种5只健康小鼠，接种后正常饲喂，观察其精神状态及死亡状况。并在小鼠死亡1 h内无菌取其肺及心脏等接种兔鲜血琼脂培养基以验证并回收病原菌。另取5只健康小鼠接种等量TSB肉汤作为空白对照。

1.6.2 药敏试验采用常规药敏纸片法测定分离菌株对临床常用抗生素的敏感性。取上述TSB肉汤纯培养产物100 μL，用L形玻璃棒均匀涂布于TSA培养基表面，室温放置10 min，待菌体固定后，用无菌镊子夹取选用的药敏纸片紧贴于琼脂表面，置于37℃恒温箱中培养24～36 h，测量抑菌圈的直径，判断分离菌株的耐药性。

2 结果

2.1 直接染色镜检

通过对病变组织的革兰氏染色，可见组织间主要分布有一种革兰氏阳性菌，菌体呈球形或卵圆形，多成对存在，部分呈较短的链状排列。

2.2 细菌的培养特性

挑取单个菌落划线接种于TSA培养基及兔鲜血琼脂培养基，置于37℃温箱中培养24～36 h后，TSA培养基上可见菌落呈单个针尖大小的灰白色半透明菌，兔鲜血琼脂培养基上可见与TSA培养基上相似且呈α溶血的菌落。

2.3 纯培养物染色镜检

将TSA培养基及兔鲜血琼脂培养基上的纯培养物进行革兰氏染色镜检，可见排列成链状的阳性球菌（图1），初步判断为链球菌。

图1 纯培养物染色镜检（400倍）

2.4 生化鉴定结果

挑取TSA培养基及兔鲜血琼脂培养基上的纯培养物进行生化鉴定，结果如表1。根据分离菌株的培养特性、染色镜检形态以及生化鉴定结果可初步判断为猪链球菌。

表1 生化鉴定结果

2.5 核酸检测结果

通过PCR扩增成功得到1 500 bp左右的目的条带（图2），将测得序列与NCBI上已发表序列通过BLAST比对可判断该菌株为猪链球菌，该序列与CP003993.1、AB071339.1、AB071340.1、AB071340.1、AF009506.1、HM590020.1、JQ975903.1等同源性均为99%。

2.6 致病性试验

5只健康小鼠在接种后12 h左右即表现精神沉郁、行动缓慢、被毛粗乱等症状，在接种18 h后开始出现死亡，36 h后全部死亡。对照组小鼠无异常反应。及时剖检死亡小鼠可见肝脏、肾脏肿大充血，肺充血。取上述组织无菌涂布于兔鲜血琼脂培养基中，37℃培养12～24 h后，培养基上生长出较均一的菌落，染色镜检与链球菌相一致，表明该菌株具有较强的致病力。

图2 PCR扩增结果

2.7 药敏试验结果

对分离猪链球菌进行药敏试验，结果显示，该菌对阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟及头孢氨苄敏感，对其余8种受试抗生素均表现耐药（表2）。

表2 药敏试验结果

3 讨论

猪链球菌病是一种重要的人畜共患急性、热性传染病，严重威胁着公共卫生安全。该病主要表现为急性出血性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、淋巴结化脓、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等症状，具有较高的发病率和死亡率，呈世界范围流行。该病可通过呼吸道、生殖道和消化道传播，也可经皮肤、黏膜创伤感染，同时还可经母猪分娩传染给仔猪。传播方式的多样性对饲养管理条件提出了严苛要求。细菌性疾病往往表现为混合感染，猪链球菌感染发病症状与副猪嗜血杆菌具有一定的相似性，均会表现呼吸困难、关节肿胀等临床症状，病理剖检均可见肺脏、肝脏损伤及心包积液、纤维素性渗出物，且常表现为混合感染；二者在抗生素耐药谱上具有较大差异，为疫病的治疗与防控带来困难。因而对病原的准确判断需要进行较完善的鉴定分析。

根据对病原的分离及进一步鉴定可确诊该病例为猪链球菌感染。且该分离株具有较强的致病性，对临床常用抗生素氟苯尼考、恩诺沙星、强力霉素、丁胺卡那霉素、四环素、林可霉素、环丙氟哌酸及苯唑西林表现耐药，而对多数β-内酰胺类及头孢类抗生素表现较为敏感。针对该病的治疗，早期常用抗生素包括四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类及头孢类等，由于抗生素的长期使用，四环素类、大环内酯类及氟喹诺酮类抗生素已经出现较严重的耐药现象[1-3]，给临床防治该病带来了难度。目前常见的细菌耐药机制主要包括：细菌整合子系统，通过捕获外源抗性基因并接合质粒使之在细菌间传播；产生灭活酶或钝化酶破坏抗生素结构使之失去作用[4]；降低细菌外膜通透性，使抗生素不易进入靶位点[5]；生物被膜（菌膜）的物理屏障及细菌群体感应作用，前者通过黏性胞外基质抵御抗生素进入[6]，后者通过激活细菌群体感应协同完成感染[7]；改变抗生素作用靶位点结构，降低细菌细胞的亲和力；产生能量依赖性主动外排蛋白，将进入菌体的抗生素泵出体外等。细菌耐药机制复杂多样，其进化速度远快于抗生素的研发速度，对于畜禽养殖及医疗卫生的威胁可想而知。因此，在合理使用抗生素的同时，还需加强各地细菌耐药情况的监测，掌握细菌耐药情况对于拟定控制措施具有重要作用。

[1]李英霞，郭大伟，李洪恩，等.红霉素与四环素耐药基因在猪链球菌临床分离株中的检测[J].畜牧与兽医，2009，41（10）：13-17.

[2]陈磊，宋娅静，吴超，等.猪链球菌耐药性及对四环素和红霉素抗生素耐药机制研究[C]//第14届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会文集.武汉：2013：133-135.

[3]芮萍，马增军，段玲欣，等.猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性与靶位突变相关性[J].畜牧兽医学报，2011，42（4）：600-604.

[4]刘钢.革兰阴性杆菌耐药机制及治疗对策[J].北京医学，2012，34（3）：197-198.

[5]Cui L,Murakami H,Kuwahara-Arai K,et al.Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed by Staphylococcus aureus Mu50[J].Antimicrobial Agents&Chemotherapy,2000,44(9): 2276-2285.

[6]李建华，宋丰贵.细菌生物膜形成与细菌耐药机制研究进展[J].中国新药与临床杂志，2008，27（1）：70-74.

[7]de Kievit T R,Iglewski B H.Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships[J].Infection&Immunity,2000,68(9): 4839-4849.

（编辑：富春妮）

S858.282.61+1

A

1002-1957(2016)03-0108-03

2016-04-24

四川省科技支撑计划（2014NZ0043）

李萍（1990-），女，四川眉山人，在读硕士研究生，主要从事病原分子生物学研究.E-mail:lipinga104@163.com

朱玲，教授，博士，主要从事病原分子生物学研究. E-mail:abtczl@126.com