刘 萍 祁兴普 刘 靖 姚 芳 李志方

(江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏 泰州 225300 )



芋头多糖提取工艺优化及其体外结合脂类和胆酸盐能力研究

刘 萍 祁兴普 刘 靖 姚 芳 李志方

(江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏 泰州 225300 )

以新鲜龙香芋为原料，对其水溶性多糖的水溶醇沉提取工艺进行优化，并通过体外模拟人体胃肠消化环境，测定其对脂肪、胆固醇、胆酸盐的结合能力，考察芋头多糖的体外降脂效果。结果表明，当提取温度80 ℃、提取时间6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇体积分数85%时，芋头多糖提取效果最好，提取率达(4.92±0.18)%。芋头多糖经过胃肠消化系统后，对脂肪和胆酸盐的吸附效果优于对照纤维素，对两者的结合能力与其质量浓度呈现显著相关性；对胆固醇的吸附效果低于纤维素，表明芋头多糖具有一定的降脂功能，降脂机理与纤维素不同。

芋头；多糖；体外降脂；胆酸；胆固醇

目前肉类、乳制品等脂肪含量较高的食品已成为日常膳食的主要来源，脂肪的过多摄入可能导致肥胖、脂肪肝、高血脂症等。高血脂症常继发于糖尿病、肾病综合症等疾病，是动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的危险因素之一[1]。有研究[2]显示，机体内血脂变化与体内总胆固醇含量变化呈正相关。因此，开发降胆固醇的药物或营养膳食以降血脂、减少心脑血管疾病的发病危险性是目前医药及膳食营养领域研究方向之一。大量研究表明植物活性多糖具有降血脂等生理活性，已证实的有银杏多糖[2]、杏鲍菇多糖[3]、何首乌多糖[4]、黑木耳多糖[5]、南瓜多糖[6]等，且几乎无副作用，部分植物多糖已用于保健食品、医药等方面[7-8]。

芋头俗称芋艿，属天南星科，是多年生块茎植物，产地遍布中国大部分地区，长江流域主要分布在泰州靖江、泰兴、兴化等地。芋头营养物质含量高，除了富含蛋白质、钙、磷、铁、钾、镁、钠、胡萝卜素、烟酸、B族维生素等多种成分外，还含有黏液多糖、黏液皂素、碱性物质等[9]生理活性物质，兼具营养和保健作用。相关研究发现芋头多糖具有一定的降脂作用，但主要集中在芋头淀粉上，如Sebnem等[10]从芋头中分离得到纯度为98%的淀粉，并进一步制备出抗性淀粉，通过体外试验得出抗性淀粉的血糖生成指数(eGI)与正常淀粉相比有显著性的下降，且两种淀粉均具有一定的胆酸结合能力，由此推测其具有潜在的降胆固醇作用。除淀粉外，芋头中的水溶性多糖也是其活性功能的关键组分，已报道有免疫调节[11]、抗氧化[12]等功能，但是尚未见有关其降脂方面的研究报道。因此，本研究拟以泰州市兴化的龙香芋为原料，优化龙香芋头中水溶性多糖的提取工艺，得到芋头粗多糖，同时通过模拟其在人体胃肠消化环境中与脂肪、胆固醇和胆酸盐结合能力，探讨芋头粗多糖的降脂效果，旨在从营养保健方面，为预防高血脂功能性芋头产品的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜龙香芋及豆油：食品级，泰州世纪联华超市；

透析袋：截留分子量3.5 kDa，上海国药集团；

α-淀粉酶：BR级，上海国药集团；

胆固醇测定试剂盒：BR级，南京建成生物工程研究所；

牛磺胆酸钠、牛胆盐：BR级，上海瑞永生物科技有限公司；

胆固醇、油酸：AR级，上海瑞永生物科技有限公司；

其他试剂：AR级，上海国药集团。

1.1.2 主要仪器

分光光度计：722型，上海棱光技术有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52D型，上海青浦沪西仪器厂；

高速冷冻离心机：Heraeus PRIMO-R型，美国Thermo Fisher公司；

冻干机：Labconco 6L型，照生有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芋头粗多糖提取工艺 在文献[12]的基础上略有修改。称取适量芋头丁(1 cm3)按料液比1∶6(g/mL)加入水，进行组织捣碎后全部转移至烧杯中，80 ℃水浴提取6 h；提取结束后多次4 000×g离心15 min去渣，合并上清液，用0.1 mol/L NaOH溶液调整pH为6.0，按照18 U/g比例加入耐高温α-淀粉酶，85 ℃酶解1.5 h，I2/KI检验直至碘液不变色。用旋转蒸发仪将水解液浓缩至约原体积的1/5。加4倍于浓缩液体积的无水乙醇，搅拌均匀后4 ℃条件下静置过夜。将静置液4 000×g离心15 min所得沉淀用Sevage法(氯仿∶正丁醇=5∶1)[13]脱蛋白，滤液经流水透析(截留分子量3.5 kDa)后冻干，制成芋头粗多糖备用。

1.2.2 芋头水分含量的测定 按GB 5009.3—2010常压干燥法执行。

1.2.3 芋头中多糖含量的测定

(1) 标准曲线的绘制：采用苯酚硫酸法[14]，以葡萄糖标准溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，测得标准曲线为y=0.079 4x+0.032 4，R2=0.999 6。

(2) 芋头粗多糖含量的测定：在文献[15]和[16]的基础上略作改动。精密称取芋头粗多糖冻干粉末10 mg，加适量水溶解，室温下超声15 min，转移至10 mL容量瓶中，用水定容，作为粗多糖供试品溶液。稀释粗多糖供试品溶液至适当浓度，准确吸取1 mL稀释液于具塞量筒中，取超纯水1 mL作空白对照，按1.2.3(1)方法测定，测定芋头多糖的含量(以芋头干重计)。

1.2.4 芋头多糖得率 按式(1)计算：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

C——测量用粗多糖溶液中葡萄糖的浓度，μg/mL；

V——测量用粗多糖溶液的体积，mL；

D——稀释倍数；

m——粗多糖供试品的质量，mg；

M1——提取所得粗多糖冻干粉的质量，g；

M0——提取用新鲜芋头的质量，g；

w——新鲜芋头水分含量，g/100 g。

1.2.5 胆酸盐含量测定 参照文献[17]。

1.2.6 芋头粗多糖提取单因素试验设计 根据已报道文献[12,15,18]，料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间是影响多糖提取率的主要因素，因此本研究以多糖得率为指标，选择以上参数对龙香芋多糖的提取工艺进行优化；所有试验都平行测定3次，取平均值。

(1) 料液比对芋头粗多糖提取率的影响：固定1.2.1方法中其他因素不变，改变料液比为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)，筛选合适的料液比。

(2) 提取温度和提取时间对芋头粗多糖提取率的影响：将芋头切成小丁，按照料液比1∶8(g/mL)进行组织捣碎，其他因素同1.2.1，分别于不同提取温度(70，75，80，85，90 ℃)下提取不同时间(4，5，6，7，8 h)，筛选合适的提取温度和提取时间。

(3) 乙醇体积分数对芋头粗多糖提取率的影响：将芋头切成小丁，按照料液比1∶8(g/mL)进行组织捣碎，在80 ℃水溶中提取6 h，其他因素同1.2.1，改变乙醇体积分数为75%，80%，85%，90%，95%，筛选合适的乙醇体积分数。

1.3 芋头多糖体外降脂试验

1.3.1 芋头多糖与油脂的结合 参考文献[19]。分别称取一定质量的芋头多糖样品和纤维素于50 mL具塞量筒中，经10 mL蒸馏水溶解后，用0.1 mol/L盐酸溶液调pH至2.0，加入10 g豆油，充分混匀，在37 ℃恒温水浴中培养2 h，取出，冷却至室温后，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液将样品pH调至7.6，37 ℃继续恒温孵育2 h后，4 ℃ 4 000 r/min离心20 min，小心移除上层未结合的油，并称取其重量，实际用油量减去剩余油量即为样品中所结合油的重量。多糖样品结合油质量减去空白对照中结合油质量即为多糖/纤维素结合脂肪量。以每克多糖结合豆油的克数表示(g/g)。同时做3组平行试验,取其平均值。

1.3.2 芋头多糖与胆固醇的结合 参照文献[20]。将不同质量的芋头多糖在胆固醇的胶束溶液中进行结合，其中1 mL胶束溶液中含有100 mmol/L牛磺胆酸钠、20 mmol/L胆固醇、50 mmol/L油酸、1 320 mmol/L氯化钠、150 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)。将空白对照、芋头多糖样品以及纤维素分别加入到胶束溶液中，然后将混合溶液在37 ℃恒温振荡水浴中培养2 h，并在10 000 r/min离心20 min，收集上清液用试剂盒测定其中胆固醇含量即为结合的胆固醇的量。以每克芋头多糖结合胆固醇的毫克数表示(mg/g)。做3次平行试验，取平均值。

1.3.3 芋头多糖与胆酸盐的结合 参照文献[20]。称取一定质量的芋头多糖样品及纤维素分别置于50 mL具塞试管中，加入5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液在37 ℃恒温水浴中培养2 h，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液将样品pH调至7.6，分别加入含0.5 mg/mL胆酸盐的pH 7.6、0.1 mol/L磷酸缓冲液10 mL，37 ℃恒温振荡水浴中消化2 h。同时做底物空白和胆盐空白。对上清液中的胆酸盐进行分析。由胆酸盐总量与未结合的胆盐量的差值计算芋头多糖结合胆盐的量，以每克芋头多糖结合胆盐的毫克数表示(mg/g)。做3次平行试验，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 芋头多糖的提取条件优化

2.1.1 料液比对芋头多糖提取率的影响 提取温度和提取时间一定时，多糖的提取量与料液比直接相关。料液比对芋头粗多糖提取率的影响见图1。

图1 料液比对多糖提取率的影响

由图1可知，芋头多糖提取率随料液比例的增大呈现上升趋势；但当料液比大于1∶6(g/mL)时，芋头多糖得率增加趋势变缓，当料液比大于1∶8(g/mL)时，多糖得率基本不变。液料比过小，溶剂量少导致溶液的黏度大，阻止多糖的有效溶出，故提取率较低[16]；当料液比增加到一定程度，即体系内溶质扩散和溶剂渗透达到动态平衡状态时，所有多糖都已全部溶出，再增加溶剂的量，多糖的溶出率基本保持不变，还会导致芋头中蛋白质等水溶性成分的溶出，导致后续多糖提取中蛋白质去除困难[15]。因此料液比取1∶8(g/mL)较适合，这与杨秀芳等[15]对陕西芋头多糖的提取结果基本一致。

2.1.2 提取温度和提取时间对芋头多糖提取率的影响 提取温度和提取时间对芋头多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，料液比不变时，当温度低于80 ℃，提取时间小于6 h时，随着提取温度的升高和提取时间的增长，芋头多糖提取率急剧增加，但当提取温度超过80 ℃时，不同温度条件下芋头多糖的提取率变化差异不大，且提取时间超过6 h之后，随提取时间的延长，提取率基本不变。这可能因为溶剂的渗透速率以及溶质的扩散速率均随温度的升高而增大，一定温度下，扩散渗透达到动态平衡，再次升高温度对多糖提取率影响不大。考虑到温度过高可能对多糖结构及活性造成不利影响，此外，在实际生产过程中长时间和高温会导致能耗增大。因此，综合考虑能耗及多糖稳定性，提取温度取80 ℃，提取时间取6 h。

图2 提取温度和提取时间对多糖提取率的影响

Figure 2 Effects of extracting temperature and time on the extraction of taro polysaccharides

2.1.3 乙醇体积分数对芋头多糖提取率的影响 乙醇体积分数是也是影响多糖提取率的重要因素之一。乙醇体积分数对芋头多糖提取率的影响见图3。由图3可知，多糖提取率与乙醇体积分数基本呈正相关，但当乙醇体积分数达85%后，随着乙醇浓度增加，多糖提取率基本维持不变，而且乙醇浓度高，更多的醇溶性杂质会析出，造成后续提纯困难。因此，芋头粗多糖提取较适的乙醇体积分数为85%。

图3 乙醇体积分数对多糖提取率的影响

2.2.4 芋头粗多糖的提取工艺优化 在以上单因素试验的基础上对提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度4个因素进行L9(34) 正交试验设计，优化芋头多糖的提取工艺。各因素和水平见表1，芋头粗多糖提取工艺的正交试验优化及方差分析结果见表2、3。

由表2可知，影响芋头多糖提取率的各因素的主次顺序依次为B>A>D>C，即提取时间影响最显著，提取温度其次，乙醇体积分数再次之，料液比影响最小。方差分析结果(表3)显示四因素中不同提取时间、提取温度和乙醇体积分数在0.1和0.05显著性水平下对芋头粗多糖得率的影响差异显著，不同料液比对多糖得率的影响不存在显著差异。即当料液比高于1∶6(g/mL)时，料液比增加基本不影响芋头得率，考虑成本，选择料液比1∶6(g/mL)为宜。这与文献[12,15]报道其它芋头品种的多糖提取料液比基本一致，可见不同品种不同地区芋头多糖水溶性差异不显著。因此提取龙香芋粗多糖的最佳组合为：A2B2C1D2，即提取温度80 ℃、提取时间6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇体积分数85%。以此最佳工艺条件进行芋头多糖提取的放大验证实验，平行3次，芋头多糖的平均提取率为(4.92±0.18)%，结果显示A2B2C1D2为最佳提取工艺组合。

表1 芋头多糖提取正交试验的因素和水平

表2 芋头多糖提取正交试验结果

表3 方差分析表

†F0.05(2,8)=4.46，F0.1(2,8)=8.64。

2.2 芋头多糖的体外降脂效果

2.2.1 芋头多糖与油脂的结合能力分析 以纤维素为对照，芋头多糖不同添加量对油脂的结合效果见图4和表4。

由图4可知，在体外模拟人体胃肠消化道环境中，芋头多糖对豆油的结合量随加入量的增加而增加，当加入的芋头多糖大于150 mg时，结合脂肪的量达到最大量(2.45±0.09) g/g，随后变化不大。因此，研究芋头多糖降脂活性的推荐添加量为150 mg。由表4可知，芋头多糖结合脂肪能力强于纤维素，后者结合脂肪能力仅为(0.76±0.05) g/g。由此推测，芋头多糖可以通过与脂肪的结合来减少脂肪在胃肠内的消化吸收，具有一定的降脂功能。这与刘静娜等[20]和王凯等[21]分别报道的壳聚糖、孔石莼多糖与脂肪的结合能力研究结果基本一致。

图4 芋头多糖添加量对脂肪结合效果的影响

Figure 4 Changes of fat-binding capacity of taro polysaccharides with different additions

表4 芋头多糖与纤维素结合脂肪能力比较

2.2.2 芋头多糖与胆固醇的结合能力分析 以纤维素为对照，不同含量的芋头多糖样品(1～3)结合胆固醇的效果见图5。

由图5可知，与对照相比，芋头多糖与胆固醇的结合能力非常小，且随含量的增加而略有下降。由此可见，芋头多糖的降脂机理与纤维素并不相同。已知纤维素作为一种不溶性膳食纤维，主要通过吸附胆固醇，形成一些不能被人体消化吸收的沉淀物，使胆固醇不易透过肠黏膜吸收进入血液而实现降低血胆固醇效果[20-21]。芋头多糖对胆固醇的结合能力很弱，说明芋头多糖不能抑制胆固醇胶束化的形成。其降脂的具体机制还需要进一步研究。

样品1. 芋头多糖7.5 mg 样品2. 芋头多糖15 mg 样品3. 芋头多糖20 mg 对照. 纤维素20 mg

图5 芋头多糖与纤维素对胆固醇结合能力的影响

Figure 5 Effects of cellulose and taro polysaccharides on cholesterol-binding capacity

2.2.3 芋头多糖与胆酸盐的体外结合能力分析 胆酸盐是一类具有甾核结构胆固醇衍生物，在机体对脂肪和胆固醇的消化吸收、脂溶性维生素的代谢中起重要作用[22-23]。不同添加量的芋头多糖样品对胆酸盐结合能力影响以及与对照纤维素结合胆酸盐能力的比较结果见图6和表5。

图6 芋头多糖添加量对胆酸盐结合能力的影响

Figure 6 Changes of bile salts-binding capacity of taro polysaccharides with different additions

表5 芋头多糖与纤维素结合胆酸盐能力比较

由图6可知，在模拟胃肠环境中，芋头多糖与胆酸盐的结合能力随含量的增加呈现先增后减的趋势，此时芋头多糖对胆酸盐的最大结合能力为(7.11±0.36) mg/g。说明芋头多糖对胆酸盐具有良好的结合能力，且最适宜添加量为12.5 mg，添加过多会因多糖黏度大使得结合能力有所下降。表5表明芋头多糖对胆酸盐的结合能力远高于纤维素，由此可推测：与纤维素吸附胆固醇不同，芋头多糖通过吸附胆酸盐，抑制其在肠道的吸收并将其排出体外，从而促进胆固醇在体内代谢转化成胆汁酸，降低了血中的胆固醇，达到降脂效果。此外，有研究[24]显示，一些多糖可能通过抑制脂肪酶和胆固醇酯酶的活性，从而抑制甘油三酯和胆固醇酯的水解，在一定程度上抑制脂肪和胆固醇的吸收。芋头多糖除结合胆酸盐外，是否也可通过抑制脂肪酶和胆固醇酯酶活性实现降脂活性，以及体内降血脂活性及其具体降脂的分子机制还不清楚，尚待进一步研究。

3 结论

(1) 在单因素基础上，通过正交试验设计优化了龙香芋多糖提取的最佳工艺条件：当提取温度80 ℃、提取时间6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇体积分数85%时，芋头多糖的提取率达(4.92±0.18)%。

(2) 以不溶性膳食纤维纤维素为对照，对提取的芋头多糖在体外模拟胃肠环境下结合脂类、胆盐、胆固醇的能力进行了比较，发现多糖与脂肪、胆酸盐、胆固醇均具有一定结合能力，对脂肪和胆酸盐的结合能力高于纤维素，而对胆固醇的结合能力却远低于纤维素。表明芋头多糖具有一定的体外降脂效果，为开发高附加值营养保健芋头产品提供了一定的理论依据。

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Optimization of polysaccharide extraction from taro and its binding capacities of lipid and bile salts in vitro

LIUPingQIXing-puLIUJingYAOFangLIZhi-fang

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangsuAgri-AnimalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu225300,China)

The extraction technology of water-soluble polysaccharides in fresh taro was investigated in this paper. Using simulated conditions of human digestioninvitro, its fat-binding, cholesterol-binding and bile salts-binding capacities were studied in order to evaluate its potential hypocholesterolemic activityinvitro. The results showed that the highest extraction efficiency of taro polysaccharide could be obtain under the conditon of using solid-liquid ratio at 1∶6, reacting at 80 ℃ for 6 h with 85% ethanol, and the extraction ratio reaches (4.92±0.18)%. Taro water-soluble polysaccharides exhibited much higher binding capacities of both fat and bile acid, while much lower one of cholesterol, compared to cellulose. The above results revealed that taro water-soluble polysaccharides could potentially alleviate the hyperlipidemia.

Taro; polysaccharide; lipid-lowering in vitro; bile acid; cholesterol

泰州市农业科技支撑项目(编号：TN2013001)；江苏省青蓝工程科技创新团队培养对象

刘萍，女，江苏农牧科技职业学院副教授，博士。

李志方(1972—)，男，江苏农牧科技职业学院副教授，硕士。E-mail：292510731@qq.com

2016-08-29

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.031