徐 晶，杜雅莉，白慧莉

(同济大学 先进土木工程材料教育部重点实验室，上海 201804)



脲解型微生物诱导碳酸钙沉积研究*

徐 晶，杜雅莉，白慧莉

(同济大学 先进土木工程材料教育部重点实验室，上海 201804)

研究了钙源种类对脲解型微生物诱导碳酸钙沉积的生物-化学过程的影响。利用电位分析法实时测试了沉积过程中钙离子、铵离子及pH值的变化，并利用显微计数对细菌浓度进行了监测。采用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和分析红外光谱(IR)对沉积产物进行了研究。结果表明，不同钙源环境下脲解型微生物诱导矿化沉积都存在化学沉淀、微生物诱导矿化沉积和沉淀完全3个阶段；有机钙源环境下细菌的产矿动力比在无机钙源中高，且两种钙源所获得的方解石晶体沉积物在形貌上差异显著。

微生物；碳酸钙沉积；矿化；裂缝修复

0 引 言

自1973年Boquet[1]首次发现并报道了土壤细菌诱导碳酸钙晶体沉积现象以来，引发了各国学者竞相开展生物修复材料在土木工程中的应用研究。Bang等[2-3]率先揭示了微生物沉积的机理，并证明了用聚亚安酯泡沫固定巴氏芽孢杆菌来修补加固混凝土裂缝可显著提高结构的强度和完整性。钱春香等[4-5]侧重开发了原位沉积技术，以实现对重大建筑工程和重要历史建筑的表面防护和开裂修复。De Belie等[6-7]的研究表明，微生物沉积能够有效减小毛细水吸附性以及气体渗透性，并最终提升结构的耐久性。Jonkers等[8-9]研究了微生物沉积用于混凝土裂缝自修复的潜质，细菌在恶劣的环境中会形成芽孢并处于休眠状态，而芽孢具有很强的抗逆性，且在基体开裂后遇水及氧气可以复苏，不断进行矿化沉积并修复裂缝。J.Xu等[10]则对微生物修复后水泥基材料的宏观和微观力学性能进行了系统研究。相比传统的修复加固，生物矿化沉积的反应条件温和、负面效应弱且相容性好，是一种环境友好的修复技术。

对于利用微生物矿化沉积来实现裂缝修复，首要任务应探明其沉积过程。前期针对性的研究已涉及了该过程的机理及其受各因素的影响规律，包括pH值、温度、浓度、钙源及其浓度等，其中钙源作为沉积过程中最关键的因素，相应系统性的研究较少。本文将从无机和有机两类钙源出发，研究其对脲解型微生物诱导矿化沉积过程的影响，以期为后续应用于混凝土裂缝修复提供指导。

1 实 验

采用巴氏芽孢八叠球菌作为菌株。作为沉积前体的无机类钙源通常使用氯化钙和硝酸钙[4]，但由于Cl-的存在会对混凝土的耐久性造成潜在影响，尤其是在有钢筋的情况下[11]。因此本文选取硝酸钙(calcium nitrate)作为无机钙源的代表。而乳酸钙(calcium lactate)作为研究最多的有机钙盐，在此处则选择为有机钙源的代表。为研究脲解型微生物的矿化沉积过程以及不同钙源对矿化沉积的影响，分别设置了无菌的对照组，每组均平行测试3瓶样品。另外，较高Ca2+浓度在碱性环境下容易发生化学沉淀，造成体系不稳，经参考既有文献，最终设置钙源浓度为0.025 mol/L[2]。各组培养基的组分如表1所示。

表1 各液体培养基组分

将未加菌的培养基置于锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌处理。菌株在30 ℃培养箱中恢复培养2 h后，无菌操作下转接到冷却后的前2组培养基中，使初始细菌浓度达到约105cell/mL，然后将锥形瓶放入恒温水浴箱中30 ℃恒温100 r/min振荡培养。

矿化沉积结束后，采用Hitachi 2360S扫描电子显微镜表征锥形瓶壁上的沉积物形貌，并采用D/max 2550VB3+/PCX射线衍射仪对瓶壁上刮取的沉积物成分进行分析。剩余培养基在80 ℃下烘干后，采用EQUINOX55红外光谱仪进行分析。

2 结果与讨论

2.1 细菌诱导矿化沉积的生物-化学过程

细菌在矿化培养基中的生长情况如图1所示。菌株转接入矿化培养基的起始浓度约105cell/mL，在诱导期细菌浓度变化不大，22～26 h的对数期细菌浓度迅速升高，至稳定期时达到约107cell/mL水平。在总体趋势上，有机钙源中的细菌繁殖更活跃。对照组中由于未接种目标菌株，未观察到细菌繁殖及生长，因此图1未给出。

图1 菌株的生长曲线

pH值变化如图2所示。活菌组的趋势都表现为先缓慢下降，随后迅速上升，最后趋于平稳；对照组最初无显著变化，后期则出现下降。

图2 pH值曲线

Ca2+浓度变化如图3所示。活菌组中Ca2+浓度在前30 h迅速下降，直到溶液内的游离Ca2+全部被结合并产生沉淀；对照组中的最初10 h Ca2+浓度出现降低，随后保持平稳，表明后期未发生游离Ca2+被结合而产生沉淀的过程。

图3 Ca2+浓度变化曲线

图浓度变化曲线

按照钙源类别的不同，将掺入活菌后的微生物矿化沉积过程进行分析，各参数的变化如图5所示。

图5 不同钙源环境下微生物的矿化沉积过程

(1)

(2)

(3)

(4)

图6 活菌试样矿化沉积过程的动力学拟合

(5)

其中，x为时间，y为离子浓度，a为y的变化范围，xc代表dy/dx最大时的时间值，k为动力学常数，k值越大即意味着动力越大。通过拟合获得的k值如表2所示。

表2 不同钙源培养基中CaCO3沉积及生成的动力学参数k值

在除钙源以外的培养基成分相同的情况下，导致有机钙源组中细菌生长繁殖的情况更好的原因与乳酸钙在细菌代谢作用下生成CO2不无关系。已有研究指出，乳酸钙在微生物代谢作用下发生的反应为[8]

(6)

2.2 XRD & SEM分析

图7为有机及无机组试样瓶壁沉积物的XRD谱，结果显示沉淀物质为CaCO3，且均属方解石晶型，这与其它研究者的实验结果一致[12-13]。

图7 沉积矿物的XRD图谱

图8为沉积产物的SEM照片。通过4组同倍数电镜图像的对比可发现，无机钙源和有机钙源沉积出来的方解石在形态上有所不同。硝酸钙的沉积物形貌大多为球形及层片状颗粒，粒径尺寸<50 μm；乳酸钙的沉积物则是不规则六面体及类球状颗粒，且颗粒尺寸更大。在碳酸钙的沉积过程中，许多外界条件都会直接影响碳酸钙的晶型和形貌[14-15]。本文则进一步证实了，作为反应物之一的钙源，其类别对沉积产物形貌有重要影响。

图8 不同钙源中沉积物的SEM图像

图中颗粒表面有许多长2～4 μm、宽0.7 μm的细印痕，这是菌体作为成核点后遗留下来的痕迹，表明菌株不仅通过新陈代谢生成的脲酶来促使方解石的沉积进行，其自身还起到了晶核的作用。

2.3 红外光谱分析

图9 培养基矿化沉积前后的IR图谱

3 结 论

(2) 细菌不仅能产生脲酶促使CaCO3沉积，还作为晶核给晶体的形成提供条件。两种钙源环境下细菌诱导沉积得到的方解石在形貌上存在显著差异：无机硝酸钙环境下的沉积物大多为球形及层片状颗粒，粒径较小；有机乳酸钙环境下的沉积物是不规则六面体及类球状颗粒，且颗粒尺寸更大。

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Investigation on ureolytic microbiologically-induced calcium carbonate precipitation

XU Jing，DU Yali，BAI Huili

(Key Laboratory of Advanced Civil Engineering Materials (Tongji University),Ministry of Education, Shanghai 201804，China)

The effects of calcium source type on the bio-chemical processes of ureolytic microbiologically-induced calcium carbonate precipitation was investigated in this paper. By using potentiometric analysis, calcium ions concentration, ammonium ions concentration, and pH value were measured. Cell density was also monitored by microscopic counting method. Sediments were characterized by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and infrared spectroscopy. The results showed that the processes of microbiologically-induced calcium carbonate precipitation consists the abiotic precipitation stage, the microbiologically-induced calcium carbonate precipitation stage, and the calcium ions depletion stage, regardless of the calcium source type. The efficiency of bacterially-induce mineralized precipitation in organic calcium source environment is higher than that in inorganic calcium source environment. Significant morphological difference of precipitated calcites from two types of calcium sources was detected.

microorganism; calcium carbonate precipitation; mineralization; crack repair

1001-9731(2016)04-04001-05

国家自然科学基金资助项目(51378011)

2015-05-22

2015-10-26 通讯作者：徐 晶，E-mail: nanonewman@126.com

徐 晶 (1984-)，男，江西抚州人，博士，副研究员，从事水泥混凝土材料教学研究工作。

Q331

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.04.001