艾柳英，吕书仪，张杰，陈文星，赖春芬，王洪滔，孙淑静

（福建农林大学生命科学学院，福州金山350002）

〈产业论坛〉

超干燥基质保藏杏鲍菇菌种及其特性和生产性能*

艾柳英，吕书仪，张杰，陈文星，赖春芬，王洪滔，孙淑静**

（福建农林大学生命科学学院，福州金山350002）

菌种退化是食用菌在保藏过程中易出现的一个难题。该研究通过比较分析由超干燥基质保藏分离的杏鲍菇菌株Ple-tm与子实体组织分离的菌株Ple-fs的形态特征、生长速度及酶活，探索超干燥基质保藏法的可行性。研究结果显示，菌株Ple-tm菌丝生长洁白浓密，生长速度明显快于菌株Ple-fs，分别为1.08 cm·d-1和0.86 cm·d-1，两者间具有极显著差异。酶活测定结果表明Ple-tm各酶活均高于同期生长的Ple-fs，漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶活分别为205.65 U·L-1、446.55 U·L-1、2.34 U·L-1、40.77 U·L-1和22.93 U·L-1。经出菇培养，Ple-tm比Ple-fs具有明显优势，产量为27.28 g·瓶-1，生物学效率比Ple-fs高26.3%，Pletm的菌丝生长速度、菌株生长周期、产量均保持原种优势。该实验表明超干燥基质保藏法可有效防止菌种退化，为食用菌菌种保藏方法的探究开辟新思路。

杏鲍菇；菌种退化；原种优势；生物学效率

食用菌菌种是食用菌生产的重要生产资料[1]，菌种的质量直接影响食用菌的栽培结果，是影响经济效益的关键因素之一[2]。菌种在栽培和保藏过程中，如果营养或培养环境控制不当，其生长代谢，菌种次生代谢物数量及质量均会受到影响[3]，发生退化现象。表现为菌种出现菌落生长速度不一致，菌丝体“吃料”速度减慢，出菇期延长，菇潮不明显，品质、产量下降，抗性降低等。此外，菌丝的代谢能力[4]、菌丝对基质降解能力，影响菌株生产周期的胞外酶活力[5-6]也会发生变化。菌种退化原因来自多方面，由遗传学、细胞学及基因突变[7]等因素导致的退化于常规条件不易改变，但保藏方法、继代次数的影响却可以优化和避免。目前常用的保藏方法有低温定期移植保藏法[3]、冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法，3种方法均需要低温，成本高。其中低温定期移植保藏法需要每隔4月～6月移植转管1次[7]，易增加继代次数，不利于长期保藏。目前尽管不断有新品种被发现与研究，但品种的老化或退化现象依然普遍存在。菌种保藏技术成熟与否关系到食用菌产业的进一步发展，因此，对菌种长期保藏技术的探究具有重要意义。

杏鲍菇（Pleurotus eryngii Quel），别名剌芹侧耳，属真菌门（Eumycota）担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）。因其具有杏仁香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感[8]，是近年来开发栽培成功的集食用、药用于一体的珍稀食用菌新品种[9]，深受广大消费者喜爱，已成为当今国内市场最具发展潜力的食用菌品种之一[10]。目前，中国、日本、韩国等都已实现杏鲍菇工厂化周年栽培[11]，在我国栽培主要集中于山东、河南、江西、福建、台湾等地。但杏鲍菇生产过程中易出现菌种退化现象，即专用菌种[9]的退化，因此，对专用菌种保藏技术的探究尤为重要。

本研究以杏鲍菇为试材，首次采用超干燥基质保藏法，通过对超干燥基质保藏分离的杏鲍菇菌株Ple-tm与子实体组织分离的菌株Ple-fs的形态特征、生长速度及酶活比较分析，探索超干燥基质保藏法的可行性。该研究将为杏鲍菇菌种保藏提供新方法，并为食用菌菌种保藏提供新思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

Ple-tm为试管超干燥基质保藏3年后分离所得的杏鲍菇菌株，首次从子实体分离；Ple-fs为杏鲍菇成熟子实体直接组织分离菌株，二者均为实验室保藏的同种杏鲍菇菌种。

1.1.2供试培养基

超干燥基质培养基：木屑25%、麸皮35%、玉米芯24%、玉米粉5%、米糠10%、石灰1%，含水量30%。

PDA加富培养基（1L）：葡萄糖20 g·L-1、马铃薯200 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、蔗渣1 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、琼脂20 g·L-1，pH自然。0.11 MPa、121℃高压灭菌20 min。液体培养基不加琼脂。

生产培养基：木屑32.5%、玉米芯35%、麸皮15%、玉米粉5%、米糠10%、碳酸钙1.5%、石灰1%，含水量65%，pH6.5～7.0。

1.2方法

1.2.1超干燥基质保藏法

超干燥基质保藏法的具体做法：按照超干燥基质培养基配方，配制试管保藏基质，121℃，180 min灭菌冷却，每个试管接种1个杏鲍菇菌块（直径1 cm），于24℃恒温培养箱中培养至菌丝长满试管（约2个月），然后转移至室温避光保藏。

1.2.2菌丝生长速度与生物量测定试验

固体培养：将菌株Ple-tm、Ple-fs接种于PDA加富培养基，转接2次，24℃恒温培养10 d，每个菌株做3个重复，每隔1 d测量菌丝生长直径、观察菌丝形态。

液体培养：将菌株接种至装有100 mL完全培养基的250 mL三角瓶中，每瓶7块（直径1 cm），每个菌株做3个重复，120 r·min-1，24℃摇床培养9 d，测定菌株生物量湿重与干重。

1.2.3粗酶液的提取

从第3天开始，每隔3 d取一次上述液体培养发酵液，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液，即为粗酶液。

1.2.4酶活测定

参照文献方法[12]，分别测定两菌株分别于3 d、6 d、9 d的漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶的酶活。

1.2.5出菇试验

根据生产培养基配方，以栽培料干重50 g·瓶-1的标准配备，装入300 mL栽培瓶中，每个菌株设置14个重复，按照工厂化栽培流程培养至收获。

收集子实体，记录产量，计算生产周期、生物学效率。生产周期为接种发菌到采收完毕时间。

1.3数据处理

数据统计分析采用DPS 7．05数据处理软件，采用单因素方差分析法进行差异显著性检验。

2　结果与分析

2.1菌株菌丝生长速度及生物量

菌株菌丝生长速度及生物量见表1，菌丝生长形态特征见图1。

表1　超干燥基质保藏杏鲍菇的菌丝生长速度及生物量Tab．1Mycelial growth rate and biomass of Pleurotus eryngii strain from the strain preservation of ultra dry substrate

图1　超干燥基质保藏杏鲍菇菌株的菌丝形态特征Fig．1Mycelial morphology characteristics of Pleurotus.eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

由表1可知，菌株Ple-tm生长直径为8．63 cm，生长速度为1．08 cm·d-1，明显快于菌株Ple-fs。两者菌丝生长直径和速度均达极显著差异。菌株Ple-tm和Ple-fs菌丝生物量干重分别为1．07 g/100mL和 0．95 g/100mL，相比无明显差异；菌丝湿重达极显著差异。

由图1可知，Ple-tm长势均匀，菌丝洁白浓密，边缘整齐，优于Ple-fs。两者菌丝生长速度差异较大，Ple-tm生长速度较快，8 d长满平皿，而Ple-fs生长较慢，10 d才长满平皿。由此可知，保藏3年后分离得到的菌株Ple-tm生长活性依然高于Ple-fs，而后者显现出较为明显的菌种退化特征。

2.2酶活测定结果

漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶酶活力比较见图2。

从图2可知，2个菌株在不同酶活上都体现出一定差异。Ple-tm的5种主要酶活力最高分别为205．65 U·L-1、446．55 U·L-1、2．34 U·L-1、40．77 U·L-1和22．93 U·L-1，后4种较Ple-fs同期酶活达极显著差异。

漆酶酶活力：前期（3 d～6 d）菌株Ple-tm漆酶酶活的较高，后期（9 d）Ple-fs菌株漆酶酶活上升，而Ple-tm漆酶酶活下降。推测由于菌株Ple-tm生长速度快于Ple-fs，后者生长滞后，于后期才表现出较高的酶活[4]（图2A)。锰过氧化物酶活力：呈现与漆酶相似的趋势（图2B)。由图2C可知，2个菌株前期木质素酶酶活力都较低，后期才表现出活性，Pletm酶活明显高于Ple-fs。木聚糖酶活力：Ple-tm、Ple-fs菌株木聚糖酶酶活力都随时间增加而升高，但菌株Ple-tm木聚糖酶酶活一直显著高于Ple-fs；后期两者仍较高但酶活已下降至第6天时的一半(图2D)。可能由于培养基中的营养[2]消耗过快导致。纤维素酶活力：在菌丝生长阶段（3 d～9 d）菌株Pletm、Ple-fs纤维素酶酶活力都随时间增加而升高，但菌株Ple-tm纤维素酶酶活一直高于菌株Ple-fs，并在第9天达极显著差异（图2E）。

综上可知，菌株Ple-tm的主要酶活皆优于同期Ple-fs菌株，由于酶活力高低程度与食用菌的生长发育及生物量息息相关[5]，体现了菌株生长活力和对基质的降解能力[6]，因此该结果间接表明Ple-tm菌株具有更强的生长代谢能力。

表2　超干燥基质保藏杏鲍菇菌株的出菇结果Tab．2Mushroom cultivation results of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

2.3出菇试验结果

菌株Ple-tm、Ple-fs出菇结果见表2，在栽培料干重相同、培养条件一致的条件下，对比2个菌株菌丝满袋、原基形成、出菇时间、出菇产量、生物学效率。2个菌株不同时期对照见图3。

由表2可见，菌株Ple-tm在栽培过程中显著地表现出原种优势，在菌丝出现、满袋、原基形成、子实体成熟时间、菌丝长势及菇的质量等方面远远超过菌株Ple-fs，菌丝满袋只用了17 d，出菇45 d，生物学效率为54．56%，而Ple-fs菌株长势弱，出菇时间延长，品质下降，菌种退化严重。

图2　超干燥基质保藏杏鲍菇菌株的5种酶活力Fig．25 kinds of enzyme activity of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

图3　超干燥基质保藏杏鲍菇的菌株栽培对照Fig．3Mushroom cultivation comparison of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

3　讨论

菌种是国家重要的生物资源，是生产、教学和科学研究的基本材料。菌种保藏过程中，不仅要保持菌种不死亡、不被杂菌污染，更主要的是保持菌种遗传性状不发生或尽可能少发生变异[13]。从1980年至今，世界各国都非常重视菌种的保藏工作，并作了大量研究[14]。本研究在前人的基础上优化配方，探索出超干燥基质保藏法，该法在文献中并无报道，也未应用于其他菌种。

研究表明，超干燥基质保藏法保藏3年后的菌株长势、主要酶活及菌株生长周期均保持原种活性，与常规保种方法比较显现绝对优势。探究机理，笔者认为可以从以下三个方面考虑：超干燥条件下水分含量极少，不能满足菌丝的进一步生长，使其生长停滞，保持于原有水平，且干燥环境不利于杂菌生长及营养物质的流失，因此，长期保藏之后菌种活性亦能保持；该方法仅需常温保藏，菌丝长期生长停滞，但不受低温刺激，既防止原基的生成，又使其保持于正常环境温度内；保藏时需避光，亦是防止光照的刺激，理由同上。这与李红等[7]提出的在保藏过程中光照、温度刺激也可引起菌种退化的观点一致，具体机理待进一步研究。

[1]刘新宇，祁玉良，熊在东，等.食用菌菌种退化的遗传学分析[J].信阳农业高等专科学校学报，2001（2）：16-18.

[2]刘海英，董月香，周廷斌，等.食用菌菌种的退化及复壮[J].食用菌，2003（6）：16-17.

[3]赫朝灿.菌种退化的原因、处理措施及菌种保藏探析[J].生物技术世界，2015（2）：1.

[4]张渊，王谦，张筱梅，等.白灵侧耳木质素酶、纤维素酶高活性菌株的诱变选育[J].河北大学学报：自然科学版，

Characteristics and Production Performance of Pleurotus eryngii Strain from Preservation of Ultra Dry Substrate

AI Liu-ying,LV Shu-yi,ZHANG Jie,CHEN Wen-xing,LAI Chun-fen,WANG Hong-tao,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Strain degradation appears easily in the strain preservation of edible fungi.In this study,in order to investigate the feasibility of ultra dry substrate used in strain preservation,the comparative analysis was performed by determining the mycelial morphology,growth speed and enzyme activity of Ple-tm strain isolated from preservation ultra dry substrate and Ple-fs strain isolated from Pleurotus eryngii fruitbody tissue.The results showed that the mycelial growth rate of Ple-tm(1.08 cm·d-1)was faster than that of Ple-fs(0.86 cm·d-1),and the difference was extremely significant.At the same time,the hyphae of Ple-tm were denser,neater and whiter.Moreover,the laccase,manganese peroxidase,lignin peroxidease,xylanase and cellulase activity of Ple-tm reached 205.65 U·L-1,446.55 U·L-1,2.34 U·L-1,40.77 U·L-1and 22.93 U·L-1,respectively.These enzymatic activities were significantly higher than those of Ple-fs during the same growth period.The mushroom cultivation experiments showed that the fruitbody production of Ple-tm strain reached 27.28 g per bottle and the biological efficiency was 26.3%higher than that of Ple-fs strain.Furthermore,Ple-tm strain could maintain the protospecies advantages in terms of mycelial growth rate,growth period and fruitbody production.These results showed that the strain preservation of ultra dry substrate can inhibit the strain degradation effectively,which will develop new strategies on the research of preservation methods of edible fungi.

Pleurotus eryngii;strain degradation;protospecies advantages;biological efficiency

S646.1

A

1003-8310（2016）04-0072-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.018

福建省食用菌产业重大农技推广服务体系建设（KNJ-153011C）；福建省发改委农业五新工程项目（闽发改委投资[2012]931号）；福建省政府专项项目（K8114002A）；福建省食用菌产业重大研发平台（2014N2101）；福建省发改委生物产业技术专项（2011878）。

艾柳英（1992-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为食用真菌学。E-mail:1178884710@qq.com

**通信作者：孙淑静（1978-），女，博士，副教授，主要从事食（药）用菌子实体生长发育机理、食用菌酶制备、食用菌遗传育种研究。

E-mail:shjsun2004@126.com

2016-05-18