龚燕川，陈影，唐杰，彭卫红，邓静

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都610066；3.四川旅游学院，四川成都610600）

〈育种与驯化〉

梯棱羊肚菌M83和M101菌株培养特性差异*

龚燕川1，2，陈影2，唐杰2，彭卫红2，邓静3**

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都610066；3.四川旅游学院，四川成都610600）

以可正常出菇的梯棱羊肚菌M83和不能正常出菇的梯棱羊肚菌M101作为供试菌株，对2种菌株在不同的温度、pH、光照、碳源、氮源上的菌丝生长速度、长势及菌核生长情况等进行分析和比较。结果表明，2种菌株菌丝的最适生长温度为15℃～25℃，但M83菌丝在5℃～30℃能正常生长，而M101菌丝在30℃不能正常生长；2种供试菌株菌丝生长最适pH为7～8，M83的生长速度明显快于M101；2种菌株菌丝在黑暗条件下的生长速度、长势均优于光暗交替条件；2种菌株可利用多种碳源和氮源，但M83对麦芽糖和可溶性淀粉的利用能力显著强于M101；2种菌株菌丝生长最适氮源为蛋白胨，对硝态氮的利用能力均强于对铵态氮的利用。

梯棱羊肚菌；出菇性能；菌丝；培养特性

羊肚菌（Morchella spp.）是羊肚菌属物种的总称，是著名食药兼用真菌，富含蛋白质、多糖、维生素、碳水化合物和矿物质等营养成分，具有提高免疫力[1]、抗氧化[2]、保护胃黏膜[3]、降血脂[4]和抗衰老[5]等功效，被广泛地应用于保健品、医药、食品、化妆品等行业。

依靠野生采集羊肚菌已经无法满足人们的食药需求，开展羊肚菌驯化栽培研究已成为各方关注的热点。梯棱羊肚菌（Morchella importuna）是当前驯化栽培中广泛使用的种类[6]，人工栽培已取得了重大进展，但对其菌丝体培养特性的研究未见报道。为了明确梯棱羊肚菌的培养特性，分析了不同出菇性能的羊肚菌在菌丝体培养阶段的差异，以期为羊肚菌菌种生产等提供信息。

1　材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试菌株及来源

经过2年的出菇栽培试验验证，选择具有不同出菇性能的梯棱羊肚菌菌株M83和M101进行试验，菌株来源及出菇性能见表1。

表1　供试菌株及来源Tab.1Test strains and sources in this paper

1.1.2培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL。

基础培养基Ⅰ：蔗糖20 g、蛋白胨2 g、琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。

基础培养基Ⅱ：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1菌种准备

制备、分装PDA培养基，121℃下灭菌30 min，制作平板。无菌条件下钩取供试菌株菌丝块，接种在平板中央，20℃避光培养3 d～4 d，备用。

1.2.2不同温度对菌丝生长的影响

用7 mm灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株接种块，接种于PDA培养基平板中央，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃培养箱中避光培养，每个处理3次重复。采用十字交叉刻度法，24 h刻度一次，测定菌丝生长速度。同时观察记录菌丝长势和菌核形成、生长情况。菌丝平均生长速度（v，mm·d-1）的计算公式为：

式中：D表示菌落直径（mm）；d表示培养天数。

1.2.3不同pH对菌丝生长的影响

用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH分别调节基础培养基Ⅰ的pH至5、6、7、8、9、10，制作平板。用7 mm灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株接种块，接种于不同pH的平板培养基中央，每个处理3次重复，20℃避光培养。测定菌丝生长速度，观察记录菌丝长势和菌核形成、生长情况。其余同1.2.2。

1.2.4不同光照条件对菌丝生长的影响

用7 mm灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株接种块，接种于PDA培养基中央，分别置于黑暗条件、12 h黑暗12 h光照（光暗交替）条件，每个处理3次重复，20℃避光培养。测定菌丝生长速度，观察记录菌丝长势和菌核形成、生长情况。其余同1.2.2。

1.2.5不同碳源对菌丝生长的影响

分别用等量甘露糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇代替基础培养基Ⅱ中的葡萄糖，制作平板培养基，用7 mm灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株接种块，接种于平板培养基中央，每个处理3次重复，20℃避光培养。测定菌丝生长速度，观察记录菌丝长势和菌核形成、生长情况。其余同1.2.2。

1.2.6不同氮源对菌丝生长的影响

分别用等量的蛋白胨、尿素、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钙代替基础培养基Ⅱ中的蛋白胨制作平板培养基，用7 mm灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株接种块接种于培养基中央，每个处理3次重复，20℃避光培养。测定菌丝生长速度，观察记录菌丝长势和菌核形成、生长情况。其余同1.2.2。

2　结果与分析

2.1培养温度对菌丝生长的影响

在PDA培养基上，供试菌株菌丝生长速度随着温度升高加快，在25℃时菌丝生长速度最快，之后，随着温度的升高，菌丝生长速度变慢，见图1。

由图1可见，菌丝长势与温度密切相关，20℃～25℃下，菌丝生长浓密粗壮，分枝较多，长势较好。不同出菇性能的菌株，菌丝长势有较大的差异。在30℃下，M101菌丝3 d后停止生长，分泌色素；M83菌丝生长较好，分枝较多，气生菌丝旺盛，培养到第5天时，菌丝开始分泌色素。总体上，M83菌丝长势强于M101。不同温度对M83和M101菌丝长势的影响见表2。

由表2可见，在20℃和25℃下，供试菌株均产生大量集中分布白色菌核。但菌核形状存在显著差异，M83菌核颗粒状，M101菌核点状，较小。M83在30℃下产生白黄色菌核，零散分布。M101在30℃下未见菌核形成。

2.2培养基pH对菌丝生长的影响

培养基pH值对菌丝生长速度的影响见图2。

图1　培养温度对梯棱羊肚菌菌丝生长速度的影响Fig.1Effect of temperature on the growth rate of M.importuna mycelium

表2　培养温度对梯棱羊肚菌M83和M101菌丝长势的影响Tab.2Effect of temperature on the mycelium growth vigor of M83 and M101

图2　培养基pH对梯棱羊肚菌菌丝生长速度的影响Fig.2Effect of pH on the growth rate of M.importuna mycelium

随着pH升高，供试菌株菌丝生长速度加快，当pH为7时，生长速度达到最快，之后，随着pH升高，菌丝生长速度下降。M83生长速度明显快于M101。不同pH条件对M83和M101菌丝长势的影响见表3。

表3　培养基pH对梯棱羊肚菌M83和M101菌丝长势的影响Tab.3Effect of pH on the mycelium growth vigor of M83 and M101

在pH小于6时，菌丝生长稀疏纤细、分枝少，随着pH升高，菌丝变得粗壮、分枝较多，当pH大于9时，菌丝长势较差。供试菌株在pH 7～8时，菌丝长势较好。供试菌株均未见菌核形成。

2.3不同光照条件对菌丝生长的影响

不同光照条件对菌丝生长的影响见图3。

图3　光照条件对梯棱羊肚菌菌丝生长速度的影响Fig.3Effect of light condition on the growth rate of M.importuna mycelium

供试菌株在这两种光照条件下均能生长，生长速度存在较明显的差异，在黑暗条件下，生长速度比光暗交替时快。同时，M83的菌丝生长速度快于M101。在黑暗条件下，气生菌丝生长旺盛。

2.4培养基碳源对菌丝生长的影响

培养基不同碳源对菌丝生长速度的影响见图4。

2种菌株菌丝在7种不同碳源培养基上均可生长。M83在以麦芽糖为碳源的培养基上生长速度最快，达到16.51 mm·d-1；在甘油和可溶性淀粉培养基上生长速度最慢。M101在以葡萄糖为碳源的培养基上生长速度最快，达到16.36 mm·d-1。研究结果显示，不能正常出菇的M101，对麦芽糖和可溶性淀粉的利用能力显著降低。不同碳源对M83和M101菌丝长势的影响见表4。

图4　碳源对梯棱羊肚菌菌丝生长速度的影响Fig.4 Effect of carbon sources on the growth rate of M.importuna mycelium

表4　培养基碳源对梯棱羊肚菌M83和M101菌丝长势的影响Tab.4Effect of carbon sources on the mycelium growth vigor of M83 and M101

供试菌株在葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖为碳源的培养基上长势均好，菌丝致密、粗壮，分枝多。尽管在以甘露醇为碳源的培养基上生长速度快，但是菌丝较纤细。供试菌株在以葡萄糖为碳源的培养基上菌丝生长速度很快，但产生菌核时间较晚，分别在11 d和12 d；在以甘露糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉为碳源的培养基上，产生大量集中分布的白色菌核。M101能够在以甘露醇为碳源的培养基上产生菌核，较其他碳源，菌核形态大小存在明显差异，分散于整个菌落中；而M83在该培养基上未产菌核。在以甘油为碳源的培养基上，供试菌株菌丝均生长较慢。

2.5培养基氮源对菌丝生长的影响

不同氮源对菌丝生长速度的影响见图5。

由图5可见，供试菌株菌丝可利用多种氮源，在7种不同氮源培养基上都可以生长。供试菌株在以蛋白胨、尿素、硝酸钾、硝酸钙为氮源的培养基上菌丝长势较好，浓密，粗壮。但在以硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为氮源的培养基上，菌丝纤细、稀疏，菌落边缘不整齐，3 d后停止生长。M83和M101对不同氮源的利用有一定差异，对硝态氮的利用优于对铵态氮的利用。不同氮源对M83和M101菌丝长势的影响见表5。

图5　氮源对梯棱羊肚菌菌丝生长速度的影响Fig.5Effect of nitrogen sources on the growth rate of M. importuna mycelium

表5　培养基氮源对梯棱羊肚菌M83和M101菌丝长势的影响Tab.5Effect of nitrogen sources on the mycelium growth vigor of the M83 and M101

供试菌株在以蛋白胨、尿素、硝酸钙为氮源的培养基上均能产生菌核。M83所产菌核均集中分布，而M101所产菌核仅在尿素培养基上集中分布。

3　讨论

温度试验结果表明不同出菇性能的供试菌株在菌丝体培养特性方面存在较大差异。M83在温度5℃～30℃范围均能生长，15℃～25℃条件下，菌丝长势较好。不能出菇的M101在30℃时生长明显弱于M83。

菌株M83、M101最适pH均为7～8，在不同pH值条件下，M83生长速度均明显快于M101。在pH试验的培养基上未见菌核产生，推测Na+或者Cl-对菌丝以及菌核的生长有一定的影响，有待进一步的研究。黑暗条件下，菌丝生长速度更快且气生菌丝更为旺盛，光暗交替对菌丝的生长有抑制作用，这与董雪[7]和小娜[8]研究结果基本一致。

供试菌株对碳源和氮源的利用也出现显著差异。结果显示梯棱羊肚菌可利用多种碳源和氮源，在以蔗糖、甘露糖、麦芽糖为碳源的培养基上能较好生长，以蔗糖最佳；对甘油和甘露醇利用较差。菌丝在以蛋白胨、尿素、硝酸钙培养基上生长较好，对有机氮源的利用率高于无机氮源，对硝态氮的利用优于铵态氮。

菌株出菇性能受多种因素的影响，本项研究结果显示，不能正常出菇的M101对麦芽糖和可溶性淀粉的利用显著低于可正常出菇的M83。对不同碳源和氮源的利用能力在一定程度上反应供试菌株体内酶的分解能力，M101某些酶活的丧失，可能意味着其基因的突变，进而影响其子实体的形成。菌株出菇能力的关键因素及机理，有待在后继工作中进一步探讨。

[1]Su CA,Xu XY,Liu DY,et al.Isolation and characterization of exopolysaccharide with immunomodulatory activity from fermentation broth of Mochella conica[J].DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,21(5):1-6.

[2]Mau JL,Chang CN,Huang SJ,et al.Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa,Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[J].Food Chemistry, 2004,87(1):111-118.

[3]罗霞，魏巍，余梦瑶.尖顶羊肚菌对急性酒精性胃黏膜损伤保护作用研究[J].菌物学报，2011，30（2）：319-324.

[4]殷伟伟，张松，吴金凤.尖顶羊肚菌活性提取物降血脂作用的研究[J].菌物学报，2009，28（6）：873-877.

[5]马利，李霞，张松.尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对皮肤成纤维细胞增殖和衰老的影响[J].菌物学报，2014，33（2）：385-393.

[6]王波，鲜灵.人工栽培羊肚菌的鉴定[J].西南农业学报，2013，26（5）：1988-1991.

[7]董雪.黑脉羊肚菌生物学特性研究[D].北京：首都师范大学，2004.

[8]和小娜.秦岭中东段地区羊肚菌的分类鉴定及生物学特性研究[D].西安：陕西师范大学，2012.

Culture Characteristics of Morchella importuna Mycelium with Different Fruiting Performance

GONG Yan-chuan1,2,CHEN Ying2,TANG Jie2,PENG Wei-hong2,DENG Jing3
(1.Institute of Biological Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China; 2.Soil and Fertilizer Research Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China; 3.Sichuan Tourism College,Chengdu 610600,China)

The Morchella importuna M83 and M101 were used as tested strains,in which the M83 was able to develop normal fruitbody and the M101 could not.The mycelium growth rate,hyphal growth and sclerotia growth of strains were analyzed and compared at different temperature,pH,light,carbon source and nitrogen source.The results showed that the optimum mycelium growth temperature of the tested strains was 15℃～25℃,the M83 mycelium grew normally at 5℃～30℃,but the M101 grew abnormally at 30℃.The optimum pH for the tested strains was 7～8,and the mycelium growth rate of M83 was much faster than that of M101.Under dark conditions,the growth rate and vigor of the mycelium were better than that of light dark alternate. Many kinds of carbon sources and nitrogen sources were used by the tested strains,but the utilization ability of M83 on the maltose and soluble starch were stronger than that of M101.The optimum nitrogen source of the tested strains was peptone,the utilization ability of nitrate nitrogen was stronger than that of ammonium nitrogen.

Morchella importuna;fruiting performance;mycelium;culture characteristics

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0007-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.003

四川省微生物资源共享平台建设（2016TJPT0002）；四川省科技厅应用基础项目（2016JY0060）；四川省科技厅应用基础项目（2015JY0163）。

龚燕川（1991-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为发酵代谢调控。E-mail:gongyanchuan@163.com

**通信作者：邓静（1970-），女，博士，教授，主要从事微生物发酵工艺及产品开发研究。E-mail:dj3930590@sina.com

2016-05-04