闪伊红 王进产 郭丽霞 闵亚杰 孙进忠

（普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471300）

猪圆环病毒2型培养工艺研究

闪伊红 王进产 郭丽霞 闵亚杰 孙进忠*

（普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471300）

本文在猪圆环病毒2型转瓶培养工艺基础上，利用NBS生物反应器和无血清培养基进行PK15-B1细胞培养，增殖猪圆环病毒2型病毒液，探索简化PCV2病毒液生产工艺、降低生产成本的方法，为今后用生物反应器微载体系统生产PCV2病毒液提供了科学依据。

PCV2生物反应器 微载体 无血清培养基 低血清培养基

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、猪皮肤和肾病综合征（PDNS）等多种疾病（总称为猪圆环病毒病，PCVDs），其临床特征为体重逐渐减轻，呼吸急促、呼吸困难和黄疸。病理学主要表现为淋巴细胞浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。感染PCV2的猪死亡率增高、饲料报酬降低，也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

传统的PCV2疫苗生产方式大多是用转瓶为细胞提供贴附表面，每个转瓶都是一个独立的细胞培养单元，其细胞质量、病毒产量和滴度均不同，导致疫苗批间差异大、操作劳动强度高，隐性污染也会引起高内毒素。微载体系统细胞培养技术自1967年被用于动物细胞大规模培养，使动物细胞培养进入高密度培养阶段，经过几十年的发展，该技术已日渐完善和成熟，正逐渐取代转瓶的生产模式。生物反应器技术虽然在一定程度上解决了转瓶技术的部分缺陷，但仍不能摆脱转瓶生产过程中所需要添加血清的缺点，朱文静［1］等指出无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外正常生长繁殖的合成培养基，其克服了含血清培养存在潜在污染源及不利于下游分离纯化等缺点；因此，在微载体细胞培养中采用不添加血清的培养基，成为细胞培养的研究热点。微载体生物反应器培养PCV2在接毒后需要培养4～7天进行病毒收获，且收获1次，生产成本较高［2］。为此，本试验研究并探讨利用生物反应器获得一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法，以克服上述缺陷，用于制备低成本、高质量的猪圆环病毒2型疫苗。

1 试验材料

1.1 细胞

PK15-B1为PK15细胞的克隆株，由普莱柯生物工程股份有限公司繁殖、鉴定和保存。

1.2 种毒

猪圆环病毒2型SH株（Porcine Circovirus Type 2，SH strain），由普莱柯生物工程股份有限公司繁殖、鉴定和保存。

1.3 培养基

Invitrus VP6培养基为瑞士CCT公司产品，OptiMEM培养基为Gibco公司产品，LSM-204培养基为北京赛百泰公司产品。

1.4 硅化剂

购自sigma公司，货号SL-2。

1.5 CelliGen生物反应器

购自NBS公司，型号：Celligen115，工作体积1L；型号：CelliGen310，工作体积10L。

1.6 PBS缓冲液配制方法

NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·12H2O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

1.7 球状微载体

Cytodex-1，购自GE公司。Cytodex-1球状微载体使用前处理：Cytodex-1经无Ca2+、Mg2+离子的PBS缓冲液清洗并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经121℃ 25min高压灭菌后，4℃密封保存备用，使用前用37℃的细胞培养液清洗3遍。

1.8 转瓶

3000ml转瓶，工作体积300ml。

2 试验方法

2.1 方瓶中培养基筛选

复苏PK15-B1细胞，用瑞士CCT、Gibco、北京赛百泰等三种无血清或低血清培养基培养，以常规基础培养基MEM（Gibco公司，使用时加入5%胎牛血清）作为对照组。采用直接适应法筛选培养基：将细胞直接从添加5%血清的MEM基础培养基转换到上述3种无血清或低血清培养基中，细胞初始接种量在0.3×106个/ml，T-75方瓶 20ml体积，37℃ 5% CO2培养。每种培养基接种7瓶细胞，培养7天观察细胞适应情况，期间每隔24h取1瓶细胞，胰酶消化后计数。培养72h-96h，细胞密度达到2.0×106个/ml，细胞活率在95%时，表明细胞已完全适应了该无血清或低血清培养基。

2.2 微载体生物反应器培养种子细胞制备

PK15-B1细胞在3000ml转瓶中用OptiMEM培养基培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成单个细胞悬液，为生物反应器培养提供种子细胞；生物反应器安装好后，进行pH电极校正。在罐体内加入PBS，夹套内加入纯水，高压蒸汽灭菌30min。冷却后安装到反应器控制系统上，连接Air、N2、O2和CO2四种气路，校正DO电极后，将罐内PBS压出，加入适量的微载体和细胞种子，参数设定：DO为50%的空气饱和度，搅拌速度65r/min，温度37℃，pH值7.2。

（1）Celligen115中微载体培养初始细胞密度优化Celligen115，工作体积1L，接种细胞悬液到已硅化处理过的含微载体接入量10g/L的生物反应器中，细胞初始接入密度分别为：0.25×106个/ml、0.5×106个/ml、0.75×106个/ml，使用筛选出的OptiMEM培养基（不添加血清）培养，比较不同细胞密度在微载体培养时维持最长时间及培养时细胞所能达到的最高细胞密度。

（2）Celligen115中微载体接入量优化Celligen115，工作体积1L，按细胞初始密度0.5×106个/ml接种细胞悬液到已硅化处理过的含微载体接入量分别为3g/L、5g/L、10g/L的生物反应器中。同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量按M.O.I.=0.2，补加300ml OptiMEM培养基。接毒后采用搅拌30min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁与病毒结合，2h后补加OptiMEM培养基至生物反应器工作体积1L。生物反应器设置参数为DO为50%，搅拌转速 65rpm，pH值7.2，采用压缩Air、O2、N2和CO2四气模式条件培养。比较不同微载体接入量对PCV2病毒的影响。

2.3 微载体生物反应器增值PCV2病毒

生物反应器工作体积为10L，微载体浓度10g/L。PK15-B1细胞在3000ml转瓶中用OptiMEM培养基培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成单个细胞悬液，为生物反应器培养提供种子细胞。

接种细胞悬液到已硅化处理过的含微载体的生物反应器中，接种初始细胞密度0.5×106个/ml。同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量按M.O.I.=0.2，补加3000ml OptiMEM培养基。接毒后采用搅拌30min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁与病毒结合，2h后补加OptiMEM培养基至生物反应器工作体积10L。生物反应器设置参数为DO为50%，搅拌转速 65rpm，采用压缩Air、O2、N2和CO2四气模式条件培养。在CelliGen310接种PCV2病毒连续试验2批，控制参数一致。

2.4 病毒收获

本试验研究采用连续收获法：接毒后72h、96h、120h、144h、168h各收获1个体积病毒液，每次收获时设定自动补料程序，一边补料（补加等体积的OptiMEM培养基）一边收获，收获的病毒液-20℃保存。每次收毒时取样测定病毒含量。

2.5 病毒滴度测定

对收获的病毒液分别采用间接免疫荧光法［3］测定病毒含量：取待测病毒液做十倍系列稀释，接入96孔细胞培养板，100μL/孔，同时接种PK15-B1细胞2.0×104/孔细胞培养板置于37℃，5% CO2培养5日，进行荧光染色判定。出现荧光的即判定该孔细胞感染，按Reed-Muench法计算病毒半数感染量（TCID50）。

3 结果

3.1 PK15-B1细胞培养基筛选

VP-6、OptiMEM、LSM-20三种培养基及添加血请的MEM培养培养PK15-B1细胞的密度及活率见图1，由图1看出，同样的初始接种密度，在VP-6和LSM-204培养基中，细胞分别可维持120h和96h，不加血清的OptiMEM培养基中，细胞可维持168h，且细胞活率在90%以上，细胞密度达到2.64×106个/ml，与添加血清的MEM培养基相当。选用OptiMEM培养基培养PK15-B1细胞，每隔72h传代一次，连续传8代，细胞状态良好且能稳定增殖见图2。

图2 OptiMEM培养基 72h（10×）

3.2 Celligen115中微载体培养初始细胞密度优化试验结果

不同接种细胞密度在生物反应器中用OptiMEM培养基培养PK15-B1细胞，结果表明：初始细胞密度0.25×106个/ml，培养至第10天时，细胞密度达到最高3.0×106个/ml；初始细胞密度0.5×106个/ml，培养至第8天时，细胞密度达到最高3.52×106个/ ml；初始细胞密度0.75×106个/ml，培养至第6天时，细胞密度达到最高3.80×106个/ml。由于病毒含量的高低与细胞密度有关，因此在生物反应器中增值PCV2以接种细胞密度0.5～0.75×106个/ml为宜，见图3A和B。

图3 A初始密度0.5×106个/ml-培养3天（10×）图3 B初始密度0.5×106个/ml-培养8天（10×）

3.3 Celligen115中微载体接入量优化试验结果

接种PK15-B1细胞0.5×106个/ml，同步接种圆环病毒PCVSH株，接毒剂量M.O.I.=0.2，接毒后72h第一次收获病毒液，之后每天收获1个体积（1L）连续收获5天。收获后病毒液-20℃保存；结果表明：微载体接入量3g/L时，PCV2病毒含量最低，为106.2TCID50/ml；5g/L时，PCV2病毒含量为107.0TCID50/ml；10g/L时，PCV2病毒含量最高，为107.4TCID50/ml以上。为此在生物反应器大规模培养时微载体接入量为10g/L。具体结果见表1。

表1 不同微载体接入量对PCV2病毒的影响（10xTCID50/mL）

3.4 PK15-B1细胞微载体生物反应器中增殖PCV2病毒连续收获

生物反应器工作体积为10L，微载体浓度为10g/L，使用OptiMEM培养基培养PK15-B1细胞增殖PCV2病毒（不加血清）；初始接种细胞密度为0.5×106个/ml，同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量M.O.I.=0.2，接毒后72h第一次收获，之后每天收获1个体积（10L）连续收获5天。收获后病毒液-20℃保存；连续培养2批，其病毒滴度均不低于107.4TCID50/ml，病毒滴度测定结果见图4。

图4 生物反应器2批试验收获5天PCV2病毒含量结果（10-×TCID50/ml）

4 讨论

目前，国内用PK15或PK15-B1细胞培养猪圆环病毒2型，均需要添加血清来维持细胞生长和病毒增殖［4-5］，生物反应器培养时，血清的添加会产生大量气泡，增加对细胞的剪切力［6］，本研究筛选出一种OptiMEM低血清培养基，不需添加血清，搅拌时可大量减少气泡的生成，降低细胞剪切力，细胞可高密度快速繁殖；另一方面，在工艺上简化操作流程，减少污染，降低生产成本，同时由于培养过程中不含血清避免血清中外源蛋白对动物机体的副反应，提升疫苗本身的安全性。

国内生产的猪圆环病毒2型疫苗在细胞培养和病毒增值过程中，不能达到高细胞密度和高病毒滴度。本研究通过在生物反应器微载体培养时的初始接种密度和微载体接入量的优化，使该悬浮培养系统所培养的PK15-B1细胞能达到高细胞密度3.52～3.80×106个/ml；利用NBS生物反应器自动补料程序收获病毒液，实现了连续收获5d，病毒滴度均不低于107.4TCID50/ml，提高了病毒收获率，为规模化生产奠定了基础。

综上所述，本研究探索了一种猪圆环病毒2型无血清大规模培养的方法，并对提高病毒收获率进行了初步探讨，为进行百升级体积的微载体在生物反应器内增殖PCV2病毒的放大培养研究提供了重要信息。

［1］ 王林山，尹燕博.PCR和IFA测定猪圆环病毒2型半数细胞培养感染量的比较［J］.上海农业学报，2013，29（1）：34-38.

［2］ 何锡忠，李春华，倪建平等：用微载体系统培养PK15细胞生产猪圆环病毒2型［J］.上海农业学报 2010.26（4）：149-151

［3］ 李智力，易小萍.细胞微载体悬浮培养生产猪细小病毒的工艺研究［J］.中国生物工程杂志China Biotechnology，2015，35（7）：62-67.

公益性行业（农业）科研专项经费（201303046）资助

闪伊红（1986-），女，河南伊川人，大专，主要从事生物反应器的应用与动物疫苗的开发。

孙进忠