李　爽，元娜，张　杏，张志刚，肖　军，苏敬良，金忠辉，

（1.北京伟嘉集团创新研究院，北京 昌平 102206；2.华北理工大学实验动物中心，河北 唐山 063000；3.北京伟嘉动物健康检测与评价中心，北京 通州 101105；4.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

李爽1，2，元娜1，3，张杏1，张志刚1，肖军3，苏敬良4，金忠辉1，4

（1.北京伟嘉集团创新研究院，北京 昌平 102206；2.华北理工大学实验动物中心，河北 唐山 063000；3.北京伟嘉动物健康检测与评价中心，北京 通州 101105；4.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

从河北廊坊养猪场采集有明显呼吸道症状的猪肺脏进行病原菌分离培养，通过对分离菌株进行形态观察、培养特性、16S rRNA测定，以及支气管败血波氏杆菌fla及Dnt基因PCR鉴定，确定成功分离鉴定到4株猪支气管败血波氏杆菌。药敏试验结果显示，分离菌株对庆大霉素、替米考星、氟苯尼考、恩诺沙星及头孢吡肟高度敏感。对小鼠具有一定致病性。

猪源支气管败血波氏杆菌；分离；鉴定；药敏试验

猪支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiesptica，Bb）是猪传染性萎缩性鼻炎的主要病原菌，单独或与产毒素多杀性巴氏杆菌混合感染可引起猪的萎缩性鼻炎［1-3］。该病呈世界流行，各种年龄的猪都有易感性，特别是幼龄猪对本病最易感，给养猪业造成巨大的经济损失，我国许多地区有此病的报道［4-6］。临床上猪支气管败血波氏杆菌多与呼吸道疾病其他致病菌混合感染，如多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒，混合感染可提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，给猪场造成严重经济损失［4-5］。

猪支气管败血波氏杆菌具有许多毒力因子，包括粘附素，如丝状血凝素（filmanetoushemagglutinin，FHA）、百日咳杆菌粘附素（pertactin），还有细菌毒素，如皮肤坏死毒素（demronecrotietoxin，DNT）、腺苷环化酶溶血素（adenylate cyclase-hemolisin，Ac-Hly）和气管细胞毒素（tracheal cytotoein），以及III型分泌系统［6］。DNT不耐热，存在于细菌胞浆内，对福尔马林敏感，细菌灭活后仍具有抗原性，可刺激机体产生抗毒素中和抗体。研究发现，DNT毒素可通过损坏呼吸道内保护层上皮细胞而促进菌株附着作用，另外DNT是Bb定居于上呼吸道所必需的因子［7］。

对采自河北省廊坊市具有明显呼吸系统症状的猪肺脏临床样本进行细菌分离、16S rRNA、fla及Dnt基因PCR鉴定，并对分离菌株进行药敏试验及小鼠的致死性试验，为猪支气管败血波氏杆菌病诊断及临床治疗提供参考。

1　材料与方法

1.1菌株与材料胰蛋白大豆琼脂（Tryptic soyagar，TSA）培养基和（Trypticase Soy Broth，TSB）培养基，购自美国BD公司；鲍-姜氏（Bodret-Gnegou）培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；TaqDNA聚合酶及基因组提取试剂盒，购自北京康为世纪生物技术有限公司；引物由北京诺赛基因研究中心有限公司合成。

1.2病料采集按常规方法剖检病猪，将采集的肺脏划线接种于含胎牛血清（5%）的TSA平皿，37℃培养24～48 h后观察，挑取可疑菌落进行传代纯化和革兰染色镜检。

1.3细菌学检查及选择性培养通过革兰染色观察，将阴性可疑菌落划线接种于普通琼脂、麦康凯、TSA及鲍-姜氏培养基，培养24 h后观察细菌生长情况。

1.416S rRNA基因PCR扩增参照细菌DNA提取试剂盒说明书，进行细菌DNA基因组提取。利用细菌16S rRNA保守区域的通用引物（上游：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游：5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′），进行PCR扩增，大小预期为750 bp。PCR反应条件：95℃预变性5 min后进入循环，94℃反应30 s，退火温度为52℃45 s，延伸时间72℃90 s，30个循环后，72℃保温10 min，4℃保存。反应结束后，取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成测序。

1.5fla及Dnt基因PCR鉴定根据参考文献合成针对猪源支气管败血波氏杆菌fla及Dnt基因引物（Fla-F：5′-TGGCGCCTGCCCTATC-3′，Fla-R：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAA-3′［8］；Dnt-1F：5′-GTGGATAAAGATGAATCGGC-3′，Dnt-1R：5′-TTA ATCAAGTTTGCGTGGCA-3′［6］；Dnt-2F：5′-ATGCTGCTTGGCGACCAGGA-3′，Dnt-2R：5′-CATTCGCTGGGTTTGTACA-3′［9］），以提取细菌DNA基因组为模板，PCR的反应体系为20 μL：2×Taq Mix 10 μL，下游引物各0.5 μL，模板1 μL，无菌水8 μL。95℃预变性5 min后进入循环，94℃反应30 s，退火温度为52℃45 s，延伸时间72℃90 s，30个循环，72℃保温10 min，4℃保存。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭（EB）染色，凝胶呈像系统扫描照相。

1.6药敏试验选取分离菌进行药敏试验，药敏试验方法和判定标准按文献进行。挑取纯化单菌落接种于含5%胎牛血清的TSB培养基，37℃培养16 h。用TSB培养基稀释菌液至终浓度为3× 108CFU/mL。用灭菌棉拭子在含有胎牛血清的TSA平皿上均匀涂布，待菌液吸收后，贴药敏纸片，37℃培养24～48 h后记录结果。

1.7小鼠致死试验挑取单菌落，接种于TSB中，于37℃培养16 h，进行活菌计数，调整菌数为1×108CFU/mL，以0.02 mL/只菌液鼻腔接种小鼠5只，同时设5只对照（每只腹腔注射TSB培养基0.02 mL），动物房内隔离饲养观察，对出现症状及死亡的小鼠进行剖检，并采集病料进行细菌分离培养。

2　结果

2.1细菌的分离及培养采集病料接种含血清的TSA平板后长出数量不等，大小一致的菌落，菌落呈半透明、凸起、表面光滑菌落，革兰染色为阴性，球杆状呈对排列，无芽孢。该细菌在普通琼脂不生长，在麦康凯平皿呈白色小菌落，在加入脱纤抗凝血的鲍-姜氏培养基上菌落形成β-溶血环，从病料中共分离到4株Bb疑似菌，命名为HB-1～HB-4。

2.216S rRNA基因序列对纯化培养的细菌16S rRNA基因特异性片段进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在大约750 bp处可见清晰条带。经测序获得的16S RNA基因序列与Gen-Bank已公布序列进行对比，结果显示分离菌株16S rRNA基因序列与多株猪支气管败血波氏杆菌（NC_HE965807，NC_JQ953663，NC_JQ953658，NC_KF601903）同源性为99.5%～100%，同源进化分析结果显示，分离菌株与猪支气管败血波氏杆菌处于同一分支（图1），表明分离菌株为猪支气管败血波氏杆菌。

图1　分离菌株16S rRNA同源进化树

2.3fla及Dnt基因PCR鉴定对分离菌进行fla及Dnt基因PCR鉴定，结果显示，分离菌株fla及Dnt基因检测均出现特异性条带，fla、Dnt1及Dnt2片段大小为237、875及740 bp（图2）。

2.4药敏试验检测结果分离菌对阿奇霉素、庆大霉素、替米考星、恩诺沙星、盐酸环丙沙星高度敏感；对诺氟沙星中度敏感；对阿莫西林、硫酸粘杆菌素低度敏感；对头孢曲松钠不敏感。

图2　分离菌株fla及Dnt基因PCR鉴定

2.5小鼠的致病性试验小鼠经鼻腔接种分离菌后，临床表现被毛杂乱、精神沉郁，食欲减退，并在72～120 h内死亡，对照组小鼠无任何临床异常表现。采集肺脏、肝脏和脾脏进行细菌分离、PCR鉴定，得到与原分离菌相同的细菌。

3　讨论

支气管败血波氏杆菌通常从尸体剖检及活体拭子中分离进行诊断，初次分离时样品含菌量少，菌落形态、生化鉴定上与很多细菌相似，给临床的分离工作带来一定的困难，导致临床分离率不高。本试验直接采集患呼吸症状的猪肺脏进行分离，并根据特异性基因PCR鉴定及16S rRNA测序对疑似细菌进行鉴定，较活体拭子分离细菌效率更高且能保证分离的准确性。有报道显示，分离过程中可用选择培养基或小鼠传代的方法能进一步提高分离效率［10］。

Bb在普通培养基中均易生长，如胰蛋白酶大豆琼脂、麦康凯琼脂、鲍-姜氏培养基等，但容易发生菌相变异［10］。苏雄等利用双层平板选择培养基并用双温培养法分离Bb，该方法的优点是能抑制其他污染杂菌和真菌的生长，但培养基配置和培养较繁琐［11］。杨佩琼等研究发现改良Smith培养基对Bb作分离效果好，另外Bb可以使培养基pH值改变导致颜色变化，易于识别菌落［12］。本研究比较几种不同培养基Bb生长情况，结果显示，分离菌株在含血清TSA平板及麦康凯生长较好，鲍-姜氏培养基出现典型的Bb I相菌菌落形态，证明分离菌为Bb I相菌。

药物添加能有效地预防或减轻波氏杆菌病的发生，但随着抗菌药物的大量使用，不断出现新的耐药菌株，细菌的耐药率也不断上升。药敏试验结果显示，分离菌对阿奇霉素、庆大霉素、替米考星、恩诺沙星、盐酸环丙沙星高度敏感；对诺氟沙星中度敏感；对阿莫西林、硫酸粘杆菌素低度敏感；对头孢曲松钠不敏感。与最近的报道结果相符［3，9］。对于预防用药物应有计划地定期轮换使用，有条件的猪场最好通过药敏试验选择敏感药物。

猪支气管败血波氏杆菌是一种鼻腔常在菌，从机体中根除的可能性不大，但对猪群的危害又不容忽视，其防治工作尤为重要。防治波氏杆菌病主要的手段是进行免疫接种配合药物治疗，另外加强管理措施和改善环境条件同样能有效降低该病发病率。通过细菌学方法、血清学方法以及PCR等途径对猪群进行监测，及时淘汰携带病原的阳性猪，以阴性猪组成基础猪群，有利于防治波氏杆菌病的发生。

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S852.61

A

0529-6005（2016）04-0051-03

2014-12-29

李爽（1984-），男，讲师，博士，从事动物疾病诊断研究，E-mail：lishuang_ncst@163.com

金忠辉，E-mail：jzh@vicagroup.com.cn