马星如，　陈颖诗，　林颖彤，　张　旭，　罗海华，　刘　超，　潘　婷

(中山大学中山医学院人类病毒学研究所，广东 广州 510080)



·实验技术·

GDF11在体外扩增CD8+记忆干性T细胞的作用*

马星如，陈颖诗，林颖彤，张旭，罗海华，刘超，潘婷△

(中山大学中山医学院人类病毒学研究所，广东 广州 510080)

目的： 探讨生长分化因子11(GDF11)在体外诱导扩增具有干细胞特性的记忆性T细胞(memory stem T cells，Tscm)中的作用，从而进一步提高免疫过继治疗的疗效。方法: 通过密度梯度离心的方法分离健康人的外周血单个核细胞，然后用磁珠分选获得CD8+T细胞；随后将所得的细胞分为实验组和对照组，实验组中加入等体积、不同浓度的GDF11，对照组中加入等体积的PBS缓冲液，最后分别在不同时点通过流式细胞术检测2组细胞中Tscm的扩增情况。结果: 在CD8+T细胞的体外扩增实验中，GDF11可以显著扩增CD8+T细胞；在CD8+T细胞的体外培养实验中，GDF11可以显著提高Tscm在CD8+T细胞中的比例。结论: GDF11可以有效地在体外扩增CD8+Tscm，为提高免疫过继治疗的效率提供了新的方法。

生长分化因子11； CD8+记忆干性T细胞； 过继免疫治疗

过继性细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的自身免疫细胞治疗方法[1-2]。 它是运用生物技术或者生物制剂对病人体内采集的免疫细胞进行体外扩增培养后回输到病人体内，使其能够激发和增强机体自身免疫功能，从而达到细胞治疗的目的。随着近年来对免疫系统认识的逐步加深，研究人员已经逐步将免疫细胞的过继治疗应用于多种肿瘤以及慢性病毒感染性疾病如艾滋病等领域[3-4]。

记忆干性T细胞(memory stem T cells,Tscm)是美国宾夕法尼亚大学医学院Emerson教授的课题组在2005年首次在小鼠体内发现并报道的[5]。这群细胞作为一种具有自我更新能力和多能性潜力的T细胞亚群，在诸多的免疫性疾病中都发挥着重要的作用。直到2011年，Nicholas教授的课题组在人的外周血细胞中也发现了这么一群干细胞样的Tscm细胞[6]。人Tscm细胞表面主要为CD45RA+CD62LhighCCR7highCD122highCD95high，在遇到抗原的时候可以迅速地产生免疫应答[7]。Tscm细胞一方面可分泌具有杀伤能力的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、granzyme B等；另一方面，在遇到抗原刺激时还可迅速分化成为效应T细胞，中央记忆性T细胞以及效应记忆性T细胞，发挥其快速免疫应答的功能[6]。近年来的研究发现，感染猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)的恒河猴体内以及HIV-1患者体内都存在一定比例的CD8+Tscm细胞，这一研究成果为HIV-1的免疫细胞治疗提供了新的思路[8-9]。因此，除了探索中央记忆性T细胞 (central memory T cells，Tcm) 和效应记忆性T细胞 (effective memory T cells，Tem)的体外扩增之外，人们还可以进一步探索如何利用体外扩增Tscm细胞来作为新的过继免疫治疗策略。

由于Tscm细胞在人体中的比例非常低，同时又具有极为重要的免疫调控作用，因此，探索如何能够诱导这种细胞快速扩增的方法就变得尤为重要和迫切。作为细胞生长分化因子的一种，生长分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)在早前的研究中被发现能够使神经干细胞加速生长分化，并且能够显著改善衰老小鼠的心脏功能[10-11]。 基于GDF11在神经干细胞以及其它干细胞生长分化方面的重要作用，本研究试图探索GDF11在体外是否可诱导人CD8+Tscm细胞的扩增，并检测其在Tscm细胞诱导分化中的作用。

材　料　和　方　法

1材料

健康人的外周成分血由广州市血液中心提供。

2主要试剂和仪器

人外周血淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物制品科技有限公司);Human CD8 T Lympohocyte Enrichment Set - DM (BD Biosciences);RPMI-1640 (Gibco);流式细胞术用抗体包括 human CD3-FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-PerCP-Cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、human CD95-APC和human CD122-PE均购自BD Pharmingen。

生物安全柜、细胞培养箱(Thermo)；离心机(Eppendorf)；光学倒置生物显微镜(Leica)；分析型流式细胞仪(BD)；细胞磁珠分选磁力架(BD Biosciences)；血球计数板 (上海市求精生化试剂仪器有限公 司)； 20 mL注射器 (北京颇赛科技发展有公司)。

3主要方法

3.1人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的分离在50 mL离心管中加入约10 mL抗凝人外周成分血，再加入约40 mL PBS (含2% BSA和0.5% EDTA) 稀释血液。混匀后把稀释后的血贴壁缓缓加入已装有25 mL人外周淋巴细胞分离液的50 mL离心管中，加满50 mL离心管为止。注意加入血液时必须保证血液浮于分离液之上。1 500 r/min离心45 min。 离心后，小心用滴管吸出悬于液体中间部位的单个核细胞，转移至15 mL离心管中，加入5倍体积的PBS缓冲液。300×g离心10 min ，并重复上一步骤1次。

3.2CD8+T细胞的分离向得到的PBMCs中加入CD8+T细胞阴选试剂盒中的 I 抗[为biotin连接的多种单抗混合物，包括：Anti-human CD4, clone L200；Anti-human CD11b/Mac-1 (CR3), clone ICRF44；Anti-human CD16, clone 3G8；Anti-human CD19, clone HIB19；Anti-human CD36, clone CB38 (NL07)；Anti-human CD41a, clone HIP8；Anti-human CD56, clone B159；Anti-human CD123 (IL-3 Receptor α chain), clone 9F5；Anti-human CD235a (Glycophorin A), clone GA-R2 (HIR2)；Anti-human γδ TCR, clone B1]，静置孵育15 min让细胞与抗体充分结合。300×g离心10 min。加入CD8+T细胞阴选试剂盒中的磁珠 II 抗(BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM)孵育30 min；随后进行过柱细胞分选，得到纯化的CD8+T细胞。

3.3CD8+T细胞的培养将纯化的CD8+T细胞重新悬浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640中，细胞计数后，按照每孔1×106的细胞数培养在预处理的48孔板中。将48孔板置于5% CO2、饱和湿度的37 ℃细胞培养箱中培养。

3.4CD8+T细胞的激活用人anti-CD3(0.5 mg/L)的抗体提前处理48孔细胞培养板4 ℃静置过夜，第2天吸去anti-CD3抗体并用PBS清洗细胞培养板。随后将CD8+T细胞铺于孔板中。每孔加入anti-CD3(1 mg/L)、anti-CD28(1 mg/L)和IL-2(10 μg/L)培养48 h，激活CD8+T细胞。

3.5GDF11因子的添加将已激活的CD8+T细胞分成实验组和对照组，实验组分别加入相同体积不同浓度的GDF11(100、200、400 μg/L)，对照组加入等体积的PBS。每隔2 d需要换1次液，同时补充加入anti-CD3(1 mg/L)、anti-CD28(1 mg/L)、IL-2(10 μg/L)和GDF11。

3.6细胞亚群的检测和分析在细胞培养的第0、1、2、3、4周，分别收取细胞标记抗体(human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-percp-cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、 human CD95-APC和human CD122-PE)检测Tscm的比例。

4统计学处理

采用SPSS 13.0分析软件进行统计分析。计量资料所有结果统一用均数±标准差(mean±SD)表示。各个实验组与对照组之间采用单因素方差分析进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1流式分析检测Tscm细胞方法的构建

本研究首先采用密度梯度离心的方法分选出人的PBMCs，再用磁珠法将PBMCs中的CD8阳性T细胞分选出来。为了保证后续实验的准确性，将磁珠分选所得的细胞用抗人CD3和CD8抗原的流式抗体通过分析型流式细胞仪检测CD8阳性T细胞的纯度，检测结果见图1。磁珠法分离出来的CD8阳性T细胞的比例为95.5%，可满足本研究后续实验的需求。

Figure 1.The purity of human CD8+T cells. Human PBMCs were isolated by density gradient centrifugation. Among the isolated PBMCs, CD8+T cells were further purified with MACS microbeads. The human CD8+T cells were labeled with anti-human CD3-FITC and anti-human CD8-APC antibodies and the purity was examined by flow cytometry.

图1人的CD8阳性T细胞的纯度检测

为了后续的流式检测方便，本研究首先构建了一个分析检测Tscm细胞的模板，见图2。将分选出来的CD8+T细胞进行7色的抗体标记，抗体分别为human CD8-Pacific blue、human CD45RA-PE-Texas red、human CD45-RO-PerCP-Cy5.5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-Alexa Fluor 700、human CD95-APC和human CD122-PE。在分析的过程中，采取4步法来鉴定和分析Tscm细胞。首先选定CD8+T细胞，然后在CD8+T细胞中选定CD45RO-CD45RA+的细胞亚群；进一步再选定出CD62L+CCR7+的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95+CD122+双阳性的细胞。该群细胞就是本研究所要关注的Tscm细胞。

2检测GDF11对CD8+Tscm细胞比例上扩增的影响

在GDF11处理后的第 1周检测，发现在CD8+T细胞中，Tscm细胞的比例会随着GDF11浓度的增加而递增，具有一定的浓度梯度依赖性。对照组中Tscm细胞的比例为0.102%，100、200和400 μg/L GDF11处理后，Tscm细胞的比例分别为0.496%、1.02%和1.41%。

与此同时，为了进一步优化GDF11对Tscm细胞的体外扩增条件，本研究选取浓度为400 μg/L的 GDF11处理CD8+T细胞，并在体外持续观察4周。然后，分别在第0、1、2、3、4周的5个时点检测Tscm细胞的比例。处理前Tscm细胞的比例为0.167%,处理第1、2、3和4周时Tscm的细胞比例分别为1.23%、3.06%、4.29%和2.52%，见图3。

Figure 2.The analytic strategy of Tscm. Firstly, the CD8+T cells were gated， and then the CD45RO-CD45RA+subset of all CD8+T cells were gated. After that, the CD62L+CCR7+cells were gated. Finally, the CD95+CD122+cells were gated and referred as Tscm.

图2Tscm细胞的分析策略

这一实验结果表明，GDF11可以在体外诱导CD8+Tscm细胞比例增加，并且具有一定的浓度梯度依赖性。同时，随着处理时间的延长，GDF11可以诱导出更多的Tscm细胞，最佳处理时间为3周。

3检测GDF11对CD8+Tscm细胞数量上的扩增影响

采用400 μg/L GDF11处理CD8+T细胞，分别在第0、1、2、3、4周检测Tscm细胞比例的同时，对CD8+T细胞进行计数，并计算出Tscm细胞的数量。对照组的细胞数量为实验起始细胞量，CD8+T细胞的数量为(1.00±0.13)×106，Tscm细胞的数量为 126±26；GDF11处理1周后，CD8+T细胞的数量为(4.63±0.83)×106，Tscm细胞的数量为2 521±338；GDF11处理2周后，CD8+T细胞的数量为(8.27±1.06)×106，Tscm细胞的数量为12 937±2 256；GDF11处理3周后，CD8+T细胞的数量为(13.83±1.72)×106，Tscm细胞的数量为47 259±9 835；GDF11处理4周后，CD8+T细胞的数量为(5.3±0.917)×106，Tscm细胞的数量为7 445±545，见图4。

这一实验结果表明，GDF11可以在体外诱导CD8+Tscm细胞数量增加，并且随着处理时间的延长，GDF11可以诱导出更多的Tscm细胞。但是，如果处理时间过长，即处理时间为4周的时候，细胞会出现一定程度的死亡。因此，GDF11处理CD8+T细胞诱导Tscm的最佳时间为3周。

讨　　论

随着人们对T细胞认识的加深以及T细胞在免疫系统中的重要作用，越来越多的研究小组尝试运用T细胞免疫过继的方式来进行肿瘤治疗[12-13]。体外长时间培养T细胞会使其失去活力，从而导致直接回输体内的T细胞存活时间较短，无法持续发挥细胞的杀伤功能。因此，人们开始尝试利用各种方式在体外扩增具有记忆功能的T细胞亚群。已有研究发现，这些具有记忆功能的T细胞亚群，如Tcm和Tem，回输后具有明显的治疗效果并且持续时间相对较长[14]。人的Tscm是近年来发现的新的一类CD8+T细胞亚群，是类似干细胞的一类记忆细胞。这类细胞具有快速免疫应答的能力，在遇到抗原刺激的时候可以迅速分化成为效应T细胞、Tcm和Tem，从而发挥其快速地免疫应答功能，这也为研究T细胞的免疫过继治疗提供了一个新的方向和思路[15]。但是，Tscm细胞在人体中的比例极低，如何在体外快速大量地扩增这类细胞用于过继免疫治疗，目前仍在寻找更好的解决方案。

Figure 3.The effect of GDF11 on the proportion of Tscm in CD8+T cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

图3GDF11对CD8+Tscm细胞比例的影响

Figure 4.The effect of GDF11 on the absolute number of Tscm in the CD8+T cells. The isolated CD8+T cells were treated with 400 μg/L GDF11. The absolute number of CD8+T cells (A) and Tscm (B) was calculated by cell counter at weeks 0， 1， 2， 3 and 4. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

图4GDF11对CD8+Tscm细胞数量的影响

本研究初步探索了体外扩增Tscm的新方法，首次利用GDF11在体外扩增CD8+Tscm细胞。GDF11蛋白大小约为45 kD，属于BMP蛋白家族和TGF-β蛋白家族，在结构上可以被水解形成一个含有7个保守的半胱氨酸残基的成熟蛋白，主要参与调控细胞的生长和分化过程。前期的小鼠和非洲蟾蜍研究表明，GDF11蛋白参与了胚胎发育期间的中胚层形成和神经发生。在我们的研究中发现，用不同浓度的GDF11处理CD8+T细胞均可以明显地促进Tscm细胞的形成，并且这种促进作用具有一定的浓度梯度依赖性。与此同时，随着CD8+T细胞数量的增加，相应的Tscm细胞数量也随之显著地增加，并在培养的第3周达到增殖的高峰期。然而，由于细胞的长期培养可能会导致细胞不同程度的死亡，在体外培养的第4周，CD8+T细胞以及Tscm细胞的数量都呈现出明显的下降趋势。因此，在GDF11处理CD8+T细胞诱导Tscm细胞形成的实验中，400 μg/L的GDF11浓度以及3周的处理条件，将是利用GDF11进行体外诱导CD8+Tscm细胞大量扩增的最佳实验组合。

综上所述，本研究采用GDF11在体外对CD8+Tscm细胞进行了有效地扩增，并探索建立其促进Tscm体外扩增的最佳实验方案，从而显著提高了CD8+Tscm细胞的扩增效率。该方法安全性较高，扩增效率明显，能为后续的抗病毒和抗肿瘤的T细胞过继免疫治疗的广泛开展提供了新的技术手段。而我们的研究也拓展了对GDF11的认识，有必要对其对免疫系统的影响做进一步的探索。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Effect of GDF11 on expansion of CD8+memory stem T cells

MA Xing-ru, CHEN Ying-shi, LIN Ying-tong, ZHANG Xu, LUO Hai-hua, LIU Chao, PAN Ting

(InstituteofHumanVirology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:pant8@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of growth differentiation factor 11 (GDF11) on the expansion of CD8+memory stem T cells (Tscm) and to further improve the effect of adoptive immunotherapy. METHODS: Healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation at first. Among the isolated PBMCs, CD8+T cells were further purified with MACS microbeads. The CD8+T cells were then randomly divided into experimental groups and control group. The same volume of different concentrations of GDF11 were added into the experimental groups, and the same volume of PBS solution was added into the control group. Finally, the expansion of Tscm in experimental groups and control group was measured by flow cytometry at several time points. RESULTS: GDF11 significantly increased the number of Tscm in CD8+T cellsinvitroexpansion and also dramatically increased the ratio of Tscm in CD8+T cells. Furthermore, 400 μg/L GDF11 treatment for 3 weeks was the optimal condition to induce CD8+Tscm. CONCLUSION: GDF11 effectively increases the number and ratio of Tscm in the CD8+T cells in cell culture growth, thereby creating a new strategy to further improve the efficiency of adoptive immunotherapy.

Growth differentiation factor 11; CD8+memory stem T cells; Adoptive immunotherapy

1000- 4718(2016)04- 0762- 07

2015- 12- 18

2016- 02- 14

国家自然科学基金资助项目(No. 31500740)；广东省引进创新科研团队项目(No. 2009010058)；“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项基金资助项目(No. 2013ZX10001004)

Tel: 020-87335703; E-mail: pant8@mail.sysu.edu.cn

R329.21； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.030

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