王　扬，　黎承杨△，　孙　春，　邓耀良，　曾国华，　王　翔，　陶芝伟，　关晓峰

(1广西医科大学第一附属医院泌尿外科，广西 南宁 530021； 2广州医科大学第一附属医院泌尿外科，广东 广州 510120)



高钙离子诱导人肾小管上皮细胞表达MCP-1和HMGB1*

王扬1，黎承杨1△，孙春1，邓耀良1，曾国华2，王翔1，陶芝伟1，关晓峰1

(1广西医科大学第一附属医院泌尿外科，广西 南宁 530021；2广州医科大学第一附属医院泌尿外科，广东 广州 510120)

目的： 观察体外培养的人肾小管上皮细胞在高钙离子环境下细胞损伤及炎性因子MCP-1和HMGB1的表达。方法: 体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)，使用CaCl2配制成不同钙离子浓度的溶液作为刺激剂，实验分为正常对照组(正常培养液)、 Ca I组(5 mmol/L Ca2+液)、 Ca II组(10 mmol/L Ca2+液)和 Ca III组(15 mmol/L Ca2+液)。各组细胞分别培养至3 h、6 h、9 h时，采用MTT法检测细胞活力。培养6 h时，采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞凋亡染色，观察各组细胞凋亡情况；同时收集细胞培养上清液，采用ELISA法分别检测各组细胞上清液过氧化氢(H2O2)和8-异前列烷(8-IP)浓度，微量酶标仪法检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。此外，培养6 h时收集各组细胞，采用real-time PCR法检测细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达情况；并收集各组细胞上清液，采用ELISA法检测其MCP-1和HMGB1的含量。结果: 随着细胞培养液中钙离子浓度的增加，细胞活力抑制率和细胞凋亡明显增加。LDH活性、细胞上清液H2O2的浓度和8-IP的含量在Ca I 组、Ca II组和Ca III组均较正常对照组高(P<0.05)。real-time PCR的结果显示，与对照组比较，3个钙离子诱导组细胞MCP-1和HMGB1 的mRNA表达水平升高，差异有统计学显著性(P<0.05)。此外，3个钙离子诱导组细胞上清液MCP-1和HMGB1含量均较正常组高(P<0.05)。结论: 本研究结果提示，高钙离子可诱导人肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤，同时细胞高表达MCP-1和HMGB1。由MCP-1和HMGB1引发的炎症反应可能是高钙尿参与结石形成的重要机制。

高钙尿； 人肾小管上皮细胞； MCP-1； HMGB1

肾结石是一种严重影响人类健康的常见病和多发病，目前发病机制仍未明确，有多种学说试图从不同角度阐明结石的形成，但都存在不足。炎症学说是近年来被学者重视的一种学说，已经有大量的研究结果[1-5]提示草酸钙肾结石的形成是一个炎症过程，尿液中的多种成分(如高钙尿、草酸和草酸钙晶体)均可单独或一同引起上皮损伤导致炎症的发生，这在草酸钙结石形成中可能起重要的作用。我们前期的临床研究[5]已经发现，在含钙肾结石患者尿液中，炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP)和高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)生成增多，但未发现尿钙水平对这2个因子的生成有明显的影响，考虑这可能是由于体内存在多种因素相互干扰的结果。由于MCP-1和HMGB1作为重要炎性因子可能是结石形成过程炎症反应的关键环节[5]，而目前在结石领域尚缺乏相关的研究，因此，本实验观察体外培养的人肾小管上皮细胞在不同高钙浓度环境下炎性因子MCP-1和HMGB1表达及对细胞损伤的影响。

材　料　和　方　法

1主要材料

人肾小管上皮细胞HK-2(中国典型培养物保藏中心)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenyl indole，DAPI)细胞凋亡染色试剂盒(贝博生物公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒和过氧化氢(H2O2)试剂盒(南京建成生物公司)；8-异前列烷(8-isoprostane, 8-IP)试剂盒(Oxford Biomedical Research)；逆转录试剂盒和real-time PCR 相关试剂，人MCP-1、HMGB1和GAPDH引物设计合成(TaKaRa)；MCP-1和HMGB1 ELISA试剂盒(武汉优尔生公司)。

2正常培养液、高钙离子培养液的配制

正常培养液为Gibco DMEM/F12+10% 胎牛血清+1%双抗。取6.66 g二水氯化钙(CaCl2·2H2O)配制成含0.3 mol/L Ca2+的母液，经过高压灭菌冷却后用DMEM/F12稀释成含5 mmol/L Ca2+、10 mmol/L Ca2+和15 mmol/L Ca2+的3种高钙离子培养液。

3实验分组

使用CaCl2配制成不同钙离子浓度溶液作为刺激剂，将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)分为4组：正常对照组(正常培养液)、Ca I 组(5 mmol/L Ca2+液)、Ca II组(10 mmol/L Ca2+液)和Ca III组(15 mmol/L Ca2+液)。各组细胞分别培养至3 h、6 h、9 h时，采用MTT法检测细胞活力。培养6 h时，采用DAPI进行细胞凋亡染色，观察各组细胞凋亡情况；同时收集细胞培养上清液，采用ELISA法分别检测各组细胞上清液H2O2和8-IP浓度，微量酶标仪法检测各组细胞上清液LDH活性。此外，培养6 h时收集各组细胞，采用real-time PCR法检测细胞MCP-1和HMGB1 的mRNA表达情况；并收集各组细胞上清液，采用ELISA法检测其MCP-1和HMGB1的蛋白含量。

4主要方法

4.1MTT实验检测各组细胞活力的抑制率取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 2×107/L的密度接种于 96 孔板，细胞融合后，更换为不含胎牛血清的正常对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组。每组设 10 个孔，3 h、6 h、9 h后，每孔加入 20 μL 的 MTT 溶液，37 ℃孵育 4 h 后，弃上清液，每孔加入 200 μL DMSO。用酶联免疫检测仪于 490 nm 波长下，测定吸光度(absorbance，A)值。根据公式：细胞活力抑制率= 1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)计算抑制率。以浓度为横轴，以抑制率为纵轴绘制细胞活力抑制曲线。

4.2DAPI细胞凋亡染色取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 1×108/L 的密度接种于 24 孔板，细胞融合后，更换为不含胎牛血清的正常对照组、Ca I、Ca II和Ca III组。6 h后加入DAPI孵育15 min,洗净后马上在荧光显微镜下观察。DAPI能与双链DNA结合，凋亡细胞表现核浓缩，染色加深或染色质呈新月型聚集于核膜一边甚至核碎裂成大小不等的凋亡小体。

4.3微量酶标法测细胞上清LDH活性取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 3×108/L 的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。6 h后收集细胞培养上清液，3 500 r/min离心10 min后-80 ℃保存。按试剂盒说明操作测得A值并计算LDH的活性。

4.4ELISA法检测各组细胞培养上清液H2O2的浓度取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 3×108/L 的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。6 h后收集细胞培养上清液，3 500 r/min离心10 min后-80 ℃保存。按试剂盒说明操作测得A值并计算H2O2的浓度。

4.5ELISA法检测各组细胞培养上清液8-IP的含量取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 3×108/L 的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。6h后收集细胞培养上清液，3 500 r/min离心10 min后-80 ℃保存。按试剂盒说明操作测得A值并计算8-IP的含量。

4.6Real-time PCR检测各组细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达水平单层培养细胞直接在6孔培养板中加入TRIzol裂解细胞，按总RNA提取试剂盒操作说明步骤提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA的浓度。去基因组反应：总RNA<1.0 μg，5× gDNA Eraser buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，42 ℃ 2 min。逆转录cDNA合成采用20 μL体系(含去基因组反应产物，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 4.0 μL，5×PrimeScript buffer 2 4.0 μL，RNase-free dH2O 1.0 μL)37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。SYBR Green染料法进行定量检测。按试剂盒说明配制反应体系，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s， 共40个循环。按以上体系以及条件分别测定待测样本目的基因及内参照的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算各样本基因表达的差异。引物由TaKaRa公司使用Primer 5软件进行设计合成。 MCP-1的上游引物为5’-AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA-3’，下游引物为5’-GGTGGTCCATGGAATCCTGA-3’，产物大小为103 bp；HMGB1的上游引物为5’-GATCCCAATGCACCCAAGAG-3’，下游引物为5’-TCGCAACATCACCAATGGAC-3’，产物大小为109 bp； GAPDH的上游引物为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，产物大小为138 bp。Real-time PCR产物最终经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4.7ELISA法检测各组细胞培养上清液MCP-1和HMGB1的蛋白含量取生长良好的第 5代 HK-2细胞，以 3×108/L 的密度接种于6孔板，待细胞融合后，加入含不同浓度钙离子的培养液。6 h后收集细胞培养上清液，3 500 r/min离心10 min后-80 ℃保存。按试剂盒说明操作测得A值。以不同浓度标准品为横坐标，A值作为纵坐标，绘制标准曲线，求得拟合方程，根据待测样本A值求出其浓度。

5统计学处理

实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，数据分析采用SPSS 16.0软件处理。当数据呈正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间两两比较采用LSD检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1细胞活力抑制率的变化

细胞活力的抑制率随着钙离子浓度的增加而增加。除Ca I组(3 h)外，其余各浓度钙离子刺激组与对照组相比较，差异均有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The cell growth curve measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.

图1MTT法计算的各组在不同时点的抑制率

2细胞凋亡情况

光学显微镜下观察，HK-2细胞呈典型螺旋状贴壁生长，随着培养液钙浓度的增加，各组细胞在形态上未见明显变化。经过 DAPI染色，荧光显微镜下观察，随着培养液钙离子浓度的增加，各组凋亡细胞增多，见图2。

3各组细胞上清液LDH的活性

对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组各组细胞上清液的LDH活性随钙离子浓度增加而逐渐增加，分别为(16.67±4.43) U/L、(54.79±2.26) U/L、(74.47±6.02) U/L和(87.77±3.76) U/L，见图3。

4各组细胞上清液H2O2浓度

对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组各组细胞上清液H2O2浓度随钙离子浓度增加而逐增渐加，分别为(17.30±0.28) mmol/L、(19.10±0.33) mmol/L、(21.56±0.28) mmol/L和(24.30±0.16) mmol/L，见图4。

Figure 2.DAPI staining for the cells in culture.

图2DAPI染色检测各组细胞凋亡情况

Figure 3.LDH activity in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图3各组细胞上清液LDH的活性

Figure 4.Hydrogen peroxide concentration in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图4各组细胞上清液H2O2浓度

5各组细胞上清液8-IP浓度

对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组各组细胞上清液8-IP浓度随钙离子浓度增加而逐渐增加，分别为(21.55±4.31) μg/L、(61.12±4.55) μg/L、(78.48±2.57) μg/L和(94.74±3.34) μg/L，见图5。

Figure 5.8-isoprostane (8-IP) concentration in the media of cell culture. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图5各组细胞上清液8-IP浓度

6各组细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达量

MCP-1、HMGB1和GAPDH的real-time PCR扩增曲线3期(基线期、指数扩增期和平台期)明显，说明基因扩增完整；而熔解曲线的主峰只有1个，无明显杂峰，说明real-time PCR定量精确，无非特异性扩增产物。此外，各基因的real-time PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，出现的片段大小与理论片段大小相符，证明产物具有特异性。MCP-1和HMGB1的mRNA在Ca I 组、Ca II组和Ca III组中的表达水平均高于对照组(P<0.05)，两个基因的表达水平在Ca II组中达到高峰，见图6。

7各组细胞上清液MCP-1和HMGB1的蛋白含量

对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组各组细胞上清液MCP-1蛋白浓度分别为(13.48±1.60) ng/L、(22.93±2.86) ng/L、(40.57±1.63) ng/L和(30.39±1.61) ng/L(P<0.05)，见图7。对照组、Ca I 组、Ca II组和Ca III组各组细胞上清液HMGB1蛋白浓度分别为(138.17±5.99) ng/L、(181.82±4.54) ng/L、(346.81±20.26) ng/L和(223.15±16.00) ng/L(P<0.05)，见图8。

Figure 6.Electrophoresis in 2% agarose gels of real-time PCR products and relative mRNA (2-ΔΔCt) expression of MCP-1 and HMGB1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图6各组MCP-1和HMGB1的mRNA表达情况

Figure 7.The concentrations of MCP-1 protein in the media. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图7各组细胞上清液MCP-1含量的变化

Figure 8.The concentrations of HMGB1 protein in the media. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图8各组细胞上清液HMGB1含量的变化

8相关性分析

采用Spearman秩相关进行相关性分析，结果发现3个钙离子诱导组中MCP-1水平和HMGB1水平呈正相关，相关系数r=0.876(P<0.05)。

讨　　论

肾结石在形成过程中，肾小管上皮细胞是暴露在高浓度的钙离子、草酸、草酸钙和/或磷酸钙晶体中的。体外研究已经发现[6]，在高浓度钙离子作用下，肾小管上皮细胞出现损伤，并呈时间和浓度依赖性。高浓度钙离子损伤上皮细胞的机制与草酸钙晶体一致，与活性氧的大量形成有关[6]。本研究结果也证实，HK-2细胞在高钙离子环境下细胞凋亡增多，细胞上清液LDH活性、过氧化氢浓度和8-IP含量增加，提示细胞出现氧化应激损伤。研究发现[1]，高浓度的钙离子、草酸、草酸钙和/或磷酸钙晶体刺激肾小管上皮细胞活性氧大量增加，激活细胞内多个分子信号通路，包括转录因子激活蛋白-1和核转录因子κB(NF-κB)，细胞大量表达炎性因子(如MCP-1、IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α等)。炎性因子可导致肾间质炎症和纤维化，同时吸引炎性细胞(如单核巨噬细胞)进入肾间质内吞噬晶体，后者又可释放活性氧和炎性因子，进一步扩大炎症反应[1-4]。上皮细胞损伤后继发出现的炎症反应被认为是参与结石形成的重要过程，是当前结石基础研究的关注点之一[1]。

体外研究发现草酸、草酸钙、磷酸钙、尿酸晶体均可促使肾小管上皮细胞表达MCP-1[2, 7-8]。对肾结石患者进行活检研究[9]发现，肾结石患者较健康对照组有更显著的肾小管损伤，在结石相邻的肾组织有MCP-1、IL-6 的mRNA表达，同时局部浸润的白细胞数与肾内MCP-1和IL-6的mRNA表达水平相关。因此，MCP-1与结石形成可能有密切的关联性。临床研究[10]发现高钙尿患者尿液MCP-1增多。我们近期的临床研究[5]也发现,与健康者比较,含钙肾结石患者尿液中MCP-1的水平明显增多，但根据患者尿钙水平进行分组比较，发现高钙尿对尿液MCP-1的生成无明显的影响。考虑到高浓度钙离子损伤上皮细胞的机制与草酸钙晶体一致，但两者没有协同作用[6]，在体内由于两者的作用都可能存在，无法确定高钙尿的作用。因此，我们建立体外细胞培养体系，观察单一因素(高钙尿)对肾小管上皮细胞生成MCP-1的影响，结果发现高钙离子环境下肾小管上皮细胞大量表达MCP-1，此结果证实高钙尿能直接刺激MCP-1的生成，而MCP-1的主要作用是趋化单核/巨噬细胞细胞进入炎症组织。尚有研究发现，由体外培养的人肾小球系膜细胞、近端小管上皮细胞和牛的肾小球上皮细胞所生成的细胞因子中，具有趋化单核细胞作用的大约70%～80%来自MCP-1[1]。因此，高钙尿刺激肾小管上皮细胞MCP-1生成在结石形成过程中的作用值得进一步研究。

本研究观察的另一个重要细胞因子HMGB1是一类在真核细胞中含量丰富的非组蛋白核蛋白，广泛分布于真核细胞淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，在核内核外都有重要的作用。在细胞核内能够参与染色质结构的调整和调节转录过程，而在体外却有强大的促进炎症的作用[11]。HMGB1作为一种晚期炎症因子可以来源于多种炎症细胞包括巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞。HMGB1能够主动分泌也能被动释放，其主要来源是坏死的细胞[12]。胞外HMGB1可以和位于多种细胞表面的晚期糖基化末端产物受体结合，激活细胞丝裂原活化蛋白激酶途经，并活化NF-κB，启动炎症反应。单核/巨噬细胞、上皮细胞和垂体细胞在内毒素或炎症因子刺激下均能分泌HMGBl[13]。近年研究[14]发现，HMGB1对小鼠巨噬细胞在体外和体内注射后均有趋化作用。单核巨噬细胞可在肾脏内晶体沉积周围出现，吞噬晶体并释放活性氧和炎性因子，参与炎症反应[1-4]。我们近期的研究[5]首次发现HMGB1在含钙肾结石患者尿液中表达增多。因此，HMGB1在结石形成过程的炎症反应中可能起重要的作用[5]。由于体内可能存在多种刺激HMGB1生成的因素，为此我们进行了本次体外研究，结果证实高钙离子在体外可单独刺激肾小管上皮细胞HMGB1的生成。

目前已经发现在肾结石的形成过程中有多种炎性因子的参与，形成了复杂的炎性网络，这些炎性因子的关联性值得深入研究。我们注意到NF-κB激活在MCP-1基因的调控方面起作用。在实验性高草酸尿动物模型研究中已经发现NF-κB的激活可以促进MCP-1的表达[15]。已经知道活性氧是炎症反应的效应器,其生成过度能激活NF-κB诱导炎症[16],而草酸钙肾结石形成与活性氧关系密切[1]，草酸和草酸钙晶体刺激肾小管上皮生成MCP-1正是通过活性氧所介导的[7-8]。HMGB1能够通过结合RAGE而激活NF-κB，启动炎症过程[17]。HMGB1可以诱导血管内皮细胞和单核细胞促炎介质的表达，包括MCP-1和多种细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)[18-19]。使用抗HMGB1中和抗体治疗动脉硬化病变，可以减少巨噬细胞的集聚和减少近72%的MCP-1的表达[14]。在研究肉芽肿肾炎时已经证实，在体外HMGB1也能够促进大鼠肾小管上皮细胞表达MCP-1[20]。由此可见，炎性因子MCP-1和HMGB1生成之间存在密切联系。可以假设，在高钙尿等病理环境下肾小管上皮HMGB1生成增多，活化NF-κB，调控MCP-1生成增多，从而有助于结石的形成。由于体内存在多种损伤及保护因素的干扰，我们前期的临床研究[5]结果并未发现HMGB1与MCP-1之间的关联性。因此，我们建立体外细胞培养体系，观察在高钙尿这单一因素的作用下，HK-2细胞表达两个炎性因子的情况。结果发现两个炎性因子的生成伴随着活性氧的增加，HMGB1与MCP-1的生成与钙离子浓度增加呈正相关，提示在高钙离子环境下，HMGB1与MCP-1的生成通过活性氧所介导，两个因子的生成存在着一定关联，但两个因子之间的关联是通过何种激活通路来完成的，尚需进一步深入研究。

综上所述，高钙离子可诱导人肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤，细胞高表达炎性细胞因子MCP-1和HMGB1。研究结果提示，由MCP-1和HMGB1引发的炎症反应可能是高钙尿参与结石形成的重要机制，但两因子之间的关联性是通过何种激活通路来完成的，尚有待进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Increases in MCP-1 and HMGB1 production in HK-2 cells exposed to high level of calcium in vitro

WANG Yang1, LI Cheng-yang1, SUN Chun1, DENG Yao-liang1, ZENG Guo-hua2, WANG Xiang1, TAO Zhi-wei1, GUAN Xiao-feng1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China；2DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:assheep@163.com)

AIM: To investigate the effect of high level of calcium on the expression of inflammatory cytokines MCP-1 and HMGB1 in human kidney epithelial HK-2 cells. METHODS: Cultured HK-2 cells were divided into control group (normal media), CaⅠgroup (5 mmol/L Ca2+media), CaⅡgroup (10 mmol/L Ca2+media) and Ca Ⅲ group (15 mmol/L Ca2+media). The cells were incubated with or without additives for 3 h, 6 h and 9 h, and the cell activity was measured by MTT assay. At 6 h, DAPI staining was used to observe the cell apoptosis. LDL activity, H2O2content and 8-isoprostane (8-IP) concentration in the media were determined by microplate reader microfiltration and ELISA. The mRNA expression of MCP-1 and HMGB1 in the cells were determined by real-time PCR, and the protein levels of MCP-1 and HMGB1 in the media were measured by ELISA. RESULTS: The results of MTT assay showed that the inhibition rate of cell activity increased significantly with the increase in calcium concentration in the media. The results of DAPI staining showed that the apoptotic cells increased with the increase in calcium concentration in the media. The LDL activity, H2O2content and 8-IP concentration in the media all increased in accordance with the increased concentrations of calcium supplemented. Compared with control group, the mRNA expression of MCP-1 and HMGB1 in the HK-2 cells increased significantly in the 3 calcium supplemented groups (P<0.05). The protein levels of MCP-1 and HMGB1 in the media of Ca I, Ca II and Ca Ⅲ groups were significantly increased compared with control group (P<0.05). CONCLUSION: The production of MCP-1 and HMGB1 in the HK-2 cells exposed to high level of calcium is significantly increased, in accordance with the oxidative cell injury.

Hypercalciuria; Human renal epithelial cells; MCP-1; HMGB1

1000- 4718(2016)04- 0726- 07

2015- 11- 18

2016- 01- 28

广西自然科学基金资助项目(No. 2011GXNSFA018177)；广东省泌尿外科重点实验室资助项目(No. 2010A060801016)

Tel: 0771-5356516; E-mail: assheep@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.024

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