胡浩然，　宣佳利，　杨解人，　李　伟，　赵梦秋，　韩　军

(皖南医学院药理学教研室，国家中医药管理局中药药理三级实验室， 安徽 芜湖 241002)



芝麻素改善自发性高血压大鼠肾损伤的作用及与PI3K/AKT/mTOR信号通路的关系*

胡浩然▲，宣佳利▲，杨解人，李伟，赵梦秋，韩军△

(皖南医学院药理学教研室，国家中医药管理局中药药理三级实验室， 安徽 芜湖 241002)

目的： 观察芝麻素对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)肾脏损伤的作用及与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的关系。方法: 雄性SHR随机分成模型组、芝麻素低剂量(80 mg/kg)、高剂量(160 mg/kg)组及卡托普利(30 mg/kg)组。同时选取同周龄WKY大鼠作为正常对照组。每日灌胃1次，模型组、正常对照组给予0.5 %羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，给药组给予CMC-Na溶解的上述剂量药物，给药前及给药后每隔2周测量1次血压。12周后，检测血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)及尿微量白蛋白(U-mAlb)含量；测定肾脏丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；HE、Masson染色观察肾组织病理学变化；TUNEL法检测肾组织细胞凋亡率；Western blot法检测肾脏p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果: 芝麻素能降低SHR舒张压，明显改善肾组织的病理学变化，降低肾脏BUN、SCr、U-mAlb、MDA含量及细胞凋亡率，提高SOD活性，显著减少p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1和Bax的蛋白水平，增加Bcl-2的蛋白表达。结论: 芝麻素减轻SHR大鼠肾脏损伤的作用机制可能与降低血压、对抗氧化应激、抑制细胞凋亡、阻滞过度活化的PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

芝麻素； 自发性高血压大鼠； PI3K/AKT/mTOR信号通路； Bax； Bcl-2

高血压肾病是原发性高血压最严重的并发症之一，可致多尿、夜尿，继而尿量减少，最终发展至慢性肾衰竭或尿毒症从而危及生命[1]。芝麻素(sesamin，Ses)是从芝麻中提取出来的一种木脂类有效活性成分，具有降低血压、血脂，抗氧化、抗肿瘤及保护与改善肝肾功能等药理作用[2]。本课题组前期实验已表明，Ses对高血压肾损伤具有拮抗作用，但深入的机制尚不明了[3]。本研究以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)为研究对象，观察Ses改善高血压肾损伤的作用与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的关系。

材　料　和　方　法

1实验动物

28只10周龄雄性SHR，7只WKY大鼠，体重180～200 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(沪)2012-0002，合格证号为2007000552035。大鼠分笼饲养，每笼4只，室温(22±2)℃，自然光照，相对湿度 60%～65%，自由饮水进食。

2药物及试剂

芝麻素(纯度≥98%)，上海纯优生物科技有限公司提供；卡托普利(captopril,Cap)片购于常州制药厂有限公司；苏木精、伊红染液试剂盒由南京建成科技有限公司提供；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)抗体、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT， p-AKT)抗体、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体均购于碧云天生物技术研究所；磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mTOR，p-mTOR)抗体由Santa Cruz提供；eIF-4E结合蛋白1(eIF-4E binding protein 1，4EBP-1)抗体、核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)抗体购自上海生工生物股份有限公司；Bax抗体、Bcl-2抗体、β-actin抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

3主要方法

3.1动物分组给药及舒张压的测量SHR适应性喂养3周后，随机分为模型(SHR)组、芝麻素低剂量(80 mg/kg)、高剂量(160 mg/kg)组及卡托普利(30 mg/kg)组，另有同周龄WKY大鼠作为正常对照组(WKY组)。给药组用 0.5%羧甲基纤维素钠作为溶剂，按上述设定剂量灌胃给药，模型组和正常对照组灌胃等体积 0.5%羧甲基纤维素钠，每日1次，连续12周。分别于给药前及给药后每2周测1次血压，用ALC-NIBP无创尾动脉血压测定分析系统，测量清醒静息状态下大鼠的尾动脉舒张压(diastolic blood pressure, DBP)。

3.2生化指标的检测ELISA法测定各组大鼠尿的微量白蛋白(urinary microcontent of albumin，U-mAlb)；全自动生物化学分析仪测定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)与血清肌酐(serum creatinine，SCr)含量；硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。具体方法和步骤严格按照试剂盒说明书操作。

3.3肾脏病理学观察肾脏组织常规石蜡包埋、切片、脱蜡水化等后，行HE和Masson染色，光镜(×400)下观察肾脏病理变化及胶原纤维增生情况。

3.4TUNEL法检测肾组织的细胞凋亡率肾脏组织切片后，按照TUNEL试剂盒说明书方法检测肾组织细胞凋亡。

3.5Western blot检测AKT、p-AKT、mTOR、p- mTOR、4EBP1、S6K1、Bax、Bcl-2的蛋白水平RIPA裂解液(400 μL RIPA+4 μL PMSF)裂解肾脏组织提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分离样品。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜，封闭液室温封闭1 h，用 I 抗孵育，4 ℃过夜。洗涤液洗膜3次(每次10 min)，将膜浸入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (1∶2 000)中，室温孵育1 h，洗膜3次(每次10 min)，室温ECL发光显色、曝光、显影、定影及分析(ImageJ 1.43分析软件进行数据处理)，条带强度用集成光密度值来表示，目的蛋白表达强度=目的蛋白集成密度值/β-actin集成密度值。

4统计学处理

采用SPSS 19.0进行统计学分析。所有实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较，根据方差齐性检验，方差齐者采用SNK-q检验法，方差不齐者采用Tamhane’s T2检验法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1芝麻素对SHR尾动脉舒张压的影响

与WKY组相比，SHR组大鼠血压明显升高(P<0.01)。与SHR组相比，在给药后8周，Ses低、高剂量组及卡托普利组的舒张压显著下降。提示芝麻素具有降低SHR尾动脉舒张压的作用，但降压效果弱于卡托普利(P<0.05)，见表1。

表1　芝麻素对SHR尾动脉舒张压的影响

Ses: sesamin; Cap: captopril.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△P<0.05,△△P<0.01vsCap.

2芝麻素对SHR肾功能的影响

与WKY组相比，SHR组大鼠的BUN、SCr、U-mAlb含量显著升高(P<0.01)。与SHR组比较，Ses组及卡托普利组的BUN、SCr、U-mAlb水平明显下降(P<0.05)。与卡托普利组相比，Ses低剂量组的BUN、U-mAlb指标水平明显偏高(P<0.01)，高剂量组各指标与卡托普利组相比无显著差异。提示芝麻素具有改善SHR肾损伤的作用，尤其高剂量组效果显著，见图1。

Figure 1.The effects of sesamin on the renal function in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

图1芝麻素对SHR肾功能的影响

3芝麻素对SHR肾组织MDA含量和SOD活性的影响

与WKY组比较，SHR组大鼠的MDA含量显著增加，SOD活性明显降低(P<0.01)；与SHR组相比，Ses高剂量组的MDA含量明显降低，SOD活性显著提高(P<0.01)，但效果弱于卡托普利组(P<0.01)。提示芝麻素改善SHR肾损伤的作用与其抗氧化应激作用有关，见图2。

4芝麻素对SHR肾组织形态学变化的影响

与WKY组比较，光镜下HE染色显示SHR组大鼠肾小球系膜细胞增生，肾小管上皮细胞出现萎缩，Masson染色显示肾小球及肾小管周围有较多蓝染胶原纤维。而给予芝麻素、卡托普利治疗后，肾小球系膜细胞未见明显增生，肾小管上皮细胞较为完好，肾小球与肾小管蓝染胶原纤维明显减少。提示芝麻素对SHR肾组织病理损伤具有一定改善作用，见图3、4。

5芝麻素对SHR肾组织细胞凋亡率的影响

WKY组几乎无棕色颗粒细胞核的凋亡细胞。与WKY组相比，SHR组大鼠凋亡细胞明显增多(P<0.01)；而给予芝麻素和卡托普利后，SHR组大鼠肾组织凋亡细胞显著减少(P<0.01)。提示芝麻素具有抑制SHR肾组织细胞凋亡的作用，但作用弱于卡托普利(P<0.05)，见图5。

Figure 2.The effects of sesamin on the renal content of MDA and activity of SOD in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

图2芝麻素对SHR肾组织MDA含量和SOD活性的影响

Figure 3.The effects of sesamin on the pathological changes of the renal tissues in the SHR (HE staining, ×400).

图3芝麻素对SHR肾组织病理学变化的影响

6芝麻素对SHR肾组织p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1蛋白水平的影响

各组总AKT和mTOR蛋白表达水平差异无统计学显著性。与WKY组相比，SHR组大鼠肾组织的AKT、mTOR蛋白磷酸化水平及4EBP1、S6K1蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与SHR组比较，芝麻素各剂量组及卡托普利组的p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1蛋白水平明显下降(P<0.05)；而与卡托普利组相比，芝麻素高剂量组降低4EBP1蛋白表达水平的作用弱于前者(P<0.01)，对以上其余指标的影响差异无统计学显著性。提示芝麻素可下调SHR肾组织AKT、mTOR蛋白磷酸化水平和4EBP1、S6K1蛋白表达水平，见图6、7。

7芝麻素对SHR肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

SHR组大鼠肾组织的Bcl-2蛋白表达水平与WKY组相比明显降低，Bax的蛋白表达水平明显升高，Bcl-2/Bax显著下降(P<0.01)；与SHR组相比，芝麻素组和卡托普利组能明显升高Bcl-2蛋白的表达，降低Bax蛋白的表达，增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01)，且芝麻素低剂量组作用稍弱于卡托普利组(P<0.05)，而高剂量组作用与后者相当。提示芝麻素可通过上调SHR肾组织Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，抑制SHR肾组织细胞凋亡，见图8。

Figure 4.The effect of sesamin on the collagen accumulation in the kidney of SHR (Masson, ×400).

图4芝麻素对SHR肾组织胶原沉积的影响

Figure 5.The effect of sesamin on the apoptosis of renal tissue in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△P<0.05,△△P<0.01vsCap.

图5芝麻素对SHR肾组织细胞凋亡率的影响

讨　　论

高血压肾损伤是由于长期高血压病情发展引起肾内小动脉、细小动脉发生病变，管腔逐渐硬化、狭窄，肾组织进行性缺血、萎缩，从而导致肾脏缺血性变化的一组临床综合征。作为血管紧张素转换酶抑制剂，卡托普利已成功用于高血压、心衰和肾脏疾病的治疗。研究表明，它不仅能有效降低血压、抗脂质过氧化，而且能改善肾小球的血流动力学，降低肾小球基底膜的通透性，降低血肌酐，尿蛋白排泄，延缓肾小球硬化等[4]。本研究采用卡托普利为阳性对照药，观察芝麻素对SHR肾损伤的作用与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的关系。

结果显示，在12周内，SHR组大鼠尾动脉舒张压随治疗时间延长逐渐降低，尤其在第8周下降显著，提示芝麻素具有降低SHR血压的作用，但作用弱于卡托普利。U-mAlb为高血压早期肾功能损害的常用检测指标，SCr、BUN为中晚期肾功能改变的检测指标。实验结果显示，SHR组大鼠U-mAlb、SCr、BUN含量均明显增加，而芝麻素能显著降低以上指标的含量，尤其高剂量组作用与卡托普利相当。其结果与我们以往报道一致[5]。HE和Masson染色结果显示，SHR组伴有肾小球损伤，肾间质纤维化及淋巴-单核细胞浸润。而用药后，芝麻素组肾脏病变有明显改善，表明芝麻素可减轻SHR肾损伤，此结果与以往报道一致[3]。

研究表明，氧化应激是高血压肾损害的重要发病机制之一，持续的高血压状态可致抗氧化活性显著降低，氧化应激水平明显增加，从而进一步导致肾组织结构的损害[6]。SOD是机体内氧自由基清除酶体系的重要成员之一，MDA为反映机体抗脂质过氧化潜在能力的重要参数，间接反映组织细胞过氧化损伤程度。实验结果提示芝麻素改善自发性高血压肾损伤的作用可能与其提高肾组织SOD水平，降低MDA含量，抑制氧化应激反应有关。

Figure 6.The effects of sesamin on the protein levels of p-AKT and p-mTOR in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

图6芝麻素对SHR肾组织AKT 和mTOR蛋白磷酸化的影响

Figure 7.The effects of sesamin on the expressions of 4EBP1 and S6K1 proteins in SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

图7芝麻素对SHR肾组织4EBP1和S6K1蛋白表达的影响

PI3K/AKT/mTOR信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径之一，在细胞生长、增殖、代谢、凋亡等过程中发挥着重要作用[7]。信号转导分子PI3K下游有多种效应分子，AKT作为该通路的中心环节，负责由PI3K始动的生物信息的传导，可作用于其下游的mTOR、核因子κB、糖原合成酶激酶3β、一氧化氮合酶、Bcl-2家族等多个靶点[8]。当机体内各类生长因子、营养物质、能量等信号发生改变，AKT的苏氨酸和丝氨酸残基会发生磷酸化而进入胞质和胞核，并通过结节性硬化复合体激活mTOR，促使其下游的S6K1与4EBP1发生磷酸化，进而调节 mRNA 翻译、蛋白质合成及能量代谢等，在细胞增殖、分化及生长过程中发挥着关键调控作用[9]。本研究结果发现，芝麻素明显降低SHR肾组织p-AKT、p-mTOR、4EBP1和S6K1的蛋白水平，其高剂量组作用与卡托普利相当。提示自发性高血压大鼠肾脏损伤可能与其激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，p-AKT、p-mTOR、4EBP1及S6K1等过度活化有关，而芝麻素可有效抑制过度活化的PI3K/AKT/mTOR信号通路。

Figure 8.The effects of sesamin on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

图8芝麻素对SHR肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

另有研究发现，氧化应激可通过多种途径诱导细胞凋亡[10]。TUNEL实验结果提示芝麻素能有效抑制SHR肾组织细胞凋亡。Bcl-2家族作为PI3K/AKT/mTOR信号通路上的重要靶点之一，在细胞凋亡的发生、发展中发挥着关键作用。Bcl-2家族中的核心成员为Bcl-2和Bax。Bcl-2可通过调控线粒体膜的完整性参与凋亡信号的调节，具有抑制细胞凋亡的作用，为凋亡的主要负调节因子。而Bax为Bcl-2活动的主要调节因子，具有抑制Bcl-2而促进细胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax的表达情况决定细胞最终的命运，Bcl-2/Bax比值升高抑制细胞凋亡，比值降低则诱导细胞凋亡[11]。本研究结果显示，芝麻素可明显上调SHR肾组织抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，下调促凋亡蛋白Bax 表达，升高Bcl-2/Bax比值，且高剂量组作用与卡托普利无明显差异。表明芝麻素减轻SHR肾损伤作用可能与其抑制细胞凋亡有关。

综上所述，我们推测，芝麻素改善自发性高血压大鼠肾脏损伤的作用机制可能与降低血压、减少氧化应激反应、抑制过度激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路及抑制细胞凋亡发生等作用有关，其深入的作用机制还有待于进一步研究。

[1]Monika K, Beata JG, Beata M, et al. Hypertensive nephropathy-A yet unsolved problem [J]. Polish Annals Med, 2014, 21(2):147-151.

[2]宣佳利，杨解人，王欢，等. 芝麻素联用维生素E对化学性肾损伤大鼠eNOS/iNOS表达的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2015, 20(1):24-30.

[3]杜少陵, 杨解人, 张俊秀, 等. 芝麻素对自发性高血压大鼠肾病的保护作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2012, 17(5): 502-507.

[4]Hrenák J, Arendášová K, Rajkoviová R, et al. Protective effect of captopril, olmesartan, melatonin and compound 21 on doxorubicin-induced nephrotoxicity in rats[J]. Physiol Res, 2013, 62 Suppl 1:S181-S189.

[5]徐朝阳，杨解人，郭莉群，等. 芝麻素对肾性高血压伴高血脂大鼠肾脏的保护作用研究[J]. 中国病理生理杂志, 2007, 23(5): 913-915.

[6]Tyther R, Ahmeda A, Johns E, et al. Proteomic profiling of perturbed protein sulfenation in renal medulla of the spontaneously hypertensive rat[J]. J Proteome Res, 2010, 9(5):2678-2687.

[7]Wang F, Li H, Yan XG, et al. Alisertib induces cell cycle arrest and autophagy and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition involving PI3K/Akt/mTOR and sirtuin 1-mediated signaling pathways in human pancreatic cancer cells[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 17(9):575-601.

[8]Zhu Y, Pereira RO, O’Neill BT, et al. Cardiac PI3K-Akt impairs insulin-stimulated glucose uptake independent of mTORC1 and GLUT4 translocation [J]. Mol Endocrinol, 2012, 27(1): 172-184.

[9]Kong XF, Wang XQ, Yin YL, et al. Putrescine stimulates the mTOR signaling pathway and protein synthesis in porcine trophectoderm cells[J]. Biol Reprod, 2014, 91(5):1-10.

[10]Matés JM, Segura JA, Alonso FJ, et al. Oxidative stress in apoptosis and cancer: an update[J]. Arch Toxicol, 2012, 86(11):1649-1665.

[11]韩军，宣佳利，胡浩然，等. 金丝桃苷预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(1):118-123.

(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Effects of sesamin on ameliorating kidney injury in spontaneously hypertensive rats and its relationship with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

HU Hao-ran, XUAN Jia-li, YANG Jie-ren, LI Wei, ZHAO Meng-qiu, HAN Jun

(DepartmentofPharmacology,PharmacologyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:aku110@ 163.com)

AIM: To study the effects of sesamin (Ses) on attenuating renal injury in spontaneously hypertensive rats (SHR) and its relationship with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.METHODS: Spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 4 groups: model (SHR) group, Ses low-dose (80 mg/kg) group, Ses high-dose (160 mg/kg) group and captopril (30 mg/kg) group. Another 7 WKY rats were given 0.5% sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na, the solvent was used to dissolve the drugs) as control group. Meanwhile, the rats in drug treatment groups were given the corresponding drugs. All animals were administered intragastrically once a day, and the blood pressure was measured every 2 weeks before and after the beginning of the administration. After 12 weeks, blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr), urine micro-albumin (U-mAlb), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were measured. The pathological changes of the renal tissues were observed under microscope with HE and Masson staining. Apoptotic rate of nephridial tissue was determined by TUNEL method. The protein levels of p-AKT, p-mTOR, 4EBP1, S6K1, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: Ses decreased the diastolic blood pressure of SHR, significantly ameliorated the pathological damage in the nephridial tissues. Compared with model group, Ses was obviously reduced the contents of SCr, BUN, U-mAlb, MDA and apoptotic rate of the kidney, decreased the protein levels of p-AKT, p-mTOR, 4EBP1, S6K1 and Bax, and increased the protein expression of Bcl-2 and SOD activity. CONCLUSION: The protective effects of Ses against renal injury in SHR may be related to decreasing blood pressure, increasing anti-oxidative stress, restraining apoptosis and inhibiting over-activated PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

Sesamin; Spontaneously hypertensive rats; PI3K/AKT/mTOR signaling pathway; Bax; Bcl-2

1000- 4718(2016)04- 0719- 07

2015- 09- 25

2016- 03- 09

安徽省教育厅自然科学基金重点项目(No.KJ2015A157); 安徽省教育厅自然科学基金一般项目(No.kj2011B200)

Tel： 0553-3932607； E-mail: aku110@163.com

R544.1; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.023

杂志网址： http://www.cjpp.net

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