卢锡基，　于　涛，　夏忠胜，　单体栋，　欧阳慧，　许稷豪，　陈其奎

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东 广州 510120)



MicroRNA-429靶向抑制occludin及对糖尿病小鼠肠上皮屏障功能的影响*

卢锡基，于涛，夏忠胜△，单体栋，欧阳慧，许稷豪，陈其奎

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东 广州 510120)

目的： 探讨microRNA-429(miR-429)在体内对糖尿病(DM)小鼠肠上皮细胞(IECs)内闭合蛋白(occludin,Ocln)表达及肠上皮屏障功能的影响。方法: 构建糖尿病小鼠模型(腹腔内注射链脲佐菌素)；通过尾静脉注射antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs内miR-429的表达；real-time PCR检测miR-429和Ocln mRNA的表达变化；Western blotting及免疫组化检测Ocln蛋白表达变化；气相色谱法检测小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值；显色基质鲎试剂法检测小鼠血浆LPS浓度。结果: 尾静脉注射antagomiRNA-429能显著抑制DM小鼠IECs内miR-429的表达，注射后6 d恢复至正常小鼠IECs表达水平。抑制DM小鼠IECs内miR-429表达后，Ocln表达显著提高(P<0.05)，小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值及血浆LPS水平均明显下降(P<0.05)。结论: AntagomiRNA-429能有效抑制DM小鼠IECs内miR-429的表达, 进而使小鼠IECs内Ocln的表达升高，从而使肠上皮屏障功能部分恢复。

糖尿病； MicroRNA-429； 闭合蛋白； 肠上皮屏障功能

MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子，长度约为19～25个核苷酸，在生物体内主要参与转录后基因表达调控，从而参与生长发育、增殖分化与凋亡等一系列生命活动[1]。闭合蛋白(occludin,Ocln)是细胞间紧密连接的重要组成部分，其在紧密连接的结构和功能维持中均起着重要作用[2- 3]。我们过去研究发现[4]，糖尿病(diabetes mellitus，DM)小鼠肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)内Ocln表达明显低于正常小鼠，但其具体调节机制尚不明确。以往有研究发现，在炎症性肠病也存在Ocln表达降低及肠上皮屏障功能障碍，而miRNA在其中起着重要调控作用[5- 6]。miRNA-429是miR-200家族的一个成员，其在细胞增殖、凋亡和肿瘤形成等过程中起着重要作用[7- 8]，但其在糖尿病肠病中的作用尚不清楚。本研究利用特异性miRNA抑制剂antagomiRNA-429降低miRNA-429的表达，观察其对Ocln表达及肠上皮屏障功能的影响。

材　料　和　方　法

1动物

SPF级C57BL/6J小鼠32只，雌雄各半，6～8周龄，18～20 g，由中山大学实验动物中心提供。IECs从小鼠小肠中分离提取。

2主要试剂

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)及乳果糖、甘露醇购自Sigma；EDTA和DTT购自上海碧云天生物技术有限公司；Ocln、β-actin兔抗多克隆抗体及HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)均购自CST；TRIzol®试剂盒购自Life Technology；miRNA专用逆转录试剂盒购自Clontech Laboratories;mRNA逆转录试剂盒和real-time PCR试剂盒购自TaKaRa；ECL试剂盒购自Santa Cruz；免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；显色基质鲎试剂盒购自厦门鲎试剂实验厂有限公司；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。AntagomiRNA-429由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；miRNA逆转录及PCR所用引物由Clontech Laboratories设计合成，其余引物由上海生工生物工程技术服务有限公司根据设计合成；PCR扩增仪采用Bio-Rad的CFX96实时荧光定量PCR仪。

3主要方法

3.1DM小鼠模型的构建将32只C57BL/6J小鼠随机分成2组，一组为DM组(26只)，另一组为正常对照(normal)组(6只)。DM组小鼠给予腹腔内注射STZ(70 mg/kg)，1天1次，连续注射5 d，normal组给予相同体积的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液腹腔内注射。1周后测尾静脉血随机血糖，连续3次测量(每天1次，连续3 d)随机血糖值大于16.7 mmol/L者为DM造模成功，造模成功率为92.3%(24/26，其中2只血糖值在12.0～16.7 mmol/L之间，未达到DM模型的标准)。

3.2DM小鼠尾静脉注射antagomiRNA-429及分组在DM小鼠造模成功后第8周时，将上述DM组小鼠随机分成2组，一组为antagomiRNA-429组(18只)，另一组为DM-NS组(6只)。 AntagomiRNA-429组：给予尾静脉注射antagomiRNA-429(80 mg/kg)，1天1次，连续注射3 d，注射后第2、4、6天分别取6只小鼠作进一步研究；DM-NS组：给予尾静脉注射生理盐水0.2 mL，1天1次，连续注射3 d。另外，normal组小鼠不做任何处理。

3.3小鼠IECs的分离提取上述各组小鼠眼眶取全血，断颈处死后，开腹并分离完整小肠(从幽门至回盲部)，沿纵轴切开小肠，留取1 cm空肠肠段用于下一步制备石蜡切片，余下肠组织用预冷的PBS清洗3遍，加入分离液I(PBS+30 mmol/L EDTA+1.5 mmol/L DTT)中，冰上放置20 min，之后将整段小肠转移至分离液II(PBS+30 mmol/L EDTA)中，37 ℃孵育10 min，然后剧烈摇晃30 s，去除肠段，将剩余液体以2 500 r/min离心5 min，去上清，沉淀物即为分离的肠上皮隐窝和绒毛组织，收集沉淀物并置于-80 ℃以作进一步研究。

3.4肠黏膜组织学检查取上述各组小鼠的小肠组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并制备组织切片。切片组织常规脱蜡、水化，过氧化物酶阻断剂避光孵育10 min，非免疫山羊血清封闭20 min，Ocln抗体(1∶250)4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育1 h，链霉素抗生物素-过氧化物酶孵育10 min，DAB显色5 min，PBS终止显色，苏木素复染30 s，脱水、封片后置于显微镜下观察。

3.5Real-time PCR采用TRIzol®试剂盒分离纯化上述各组IECs的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。各取0.5 μg总RNA，分别参照miRNA专用逆转录试剂盒和mRNA逆转录试剂盒实验操作说明进行相应real-time PCR。然后进行real-time PCR扩增， PCR条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环，样本目的基因的相对表达率采用ΔΔCt方法计算，miR-429的表达以U6为内参照，Ocln的表达以18S rRNA为内参照。miR-429顺义引物序列为5’-TAATACTGTCTGGTAATGCCG-3’，反义通用引物包含在miRNA专用逆转录试剂盒中；U6顺义引物序列为5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，反义通用引物包含在miRNA专用逆转录试剂盒中；Ocln上游引物为5’-CCTCCAATGGCAAAGTGAAT-3’,下游引物为5’-CTCCCCACCTGTCGTGTAGT-3’；18S rRNA上游引物为5’-GCTAGGAATAATGGAATAGG-3’,下游引物物 5’-ACT TTCGTTCTTGAGGAATG-3’。

3.6Western blotting每组各取总蛋白40 μg在12%的分离胶中进行SDS-PAGE分离，然后在冰上以200 mA恒流转膜2 h，继而用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应Ⅰ抗(Ocln，1∶1 000；β-actin，1∶5 000),4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min 3次，用过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min 3次，曝光、显影与定影。

3.7血浆LPS浓度测定将上述各组小鼠所取的全血置于含抗凝剂的离心管中，充分混匀后以3 000 r/min离心10 min，取血浆，参照显色基质鲎试剂盒操作说明进行血浆LPS浓度测定。

3.824 h尿液乳果糖/甘露醇比值(lactulose/mannitol ratio, L∶M ratio)上述各组小鼠给予胃内灌注乳果糖(每只10 mg)和甘露醇(每只5 mg)，收集24 h尿液，用GC-9A气相色谱仪检测乳果糖及甘露醇浓度并计算其比值。

4统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用独立样本的t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间的两两比较用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1DM小鼠IECs高表达miR-429

DM小鼠IECs内miR-429的表达显著高于正常小鼠IECs的表达(P<0.05)，见图1。

Figure 1.miR-429 expression in IECs from normal and DM mice. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsnormal group.

图1正常和DM小鼠IECs中miR-429的表达情况

2注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429表达逐步降低

如图2所示，经尾静脉注射antagomiRNA-429后，DM小鼠IECs内miR-429的表达逐步降低(P<0.05)，并在注射后的第6天接近正常小鼠水平，因此我们选定这一天的小鼠来进行肠上皮组织提取用作下一步实验。

Figure 2.The expression of miR-429 in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

图2经尾静脉注射antagomir-429后DM小鼠IECs中miR-429的表达

3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln表达明显升高

经尾静脉注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429组小鼠IECs内Ocln的mRNA和蛋白表达量均明显高于DM-NS组，差异具有统计学意义(P<0.05)。另外，Ocln主要表达在小鼠IECs的细胞膜上，尤其集中于肠腔面细胞连接处，而且antagomiRNA-429组小鼠IECs上的Ocln表达明显高于DM-NS组,见图3。

4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血浆LPS浓度及尿液乳果糖/甘露醇比值均明显降低

DM小鼠血浆LPS浓度远高于正常小鼠。经尾静脉注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429组小鼠血浆LPS浓度明显低于DM-NS组(P<0.05)。DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值显著高于正常小鼠。经尾静脉注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429组小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值明显低于DM-NS组，差异具有统计学意义(P<0.05),见图4。

讨　　论

闭合蛋白是细胞间紧密连接的重要组成部分，其在紧密连接的结构和功能维持中均起着重要作用。过去关于Ocln在肠屏障功能中作用的研究主要集中在肠道炎性疾病。Burewer等[9]的研究表明，在肠道炎性疾病中促炎因子IFN-γ和TNF-α可促使Ocln从胞膜转移至胞质中并促进肠上皮细胞凋亡，从而使肠上皮细胞间紧密连接受损，破坏肠上皮屏障。王爱丽等[10]的研究发现，在大鼠肠道缺血再灌注损伤模型中，肠组织Ocln蛋白表达明显降低，肠黏膜通透性增加。另外，Schumann等[11]报道了在难治性乳糜泻的病人中也存在肠上皮细胞间紧密连接受损、肠上皮屏障功能障碍。在我们过去的研究中发现[4]，在DM小鼠中也存在肠上皮细胞内Ocln表达下降，肠上皮紧密连接受损，以及肠屏障功能障碍，但其调节因素尚待进一步研究。

Figure 3.The expression and distribution of Ocln in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429 (immunohistochemistry,×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group；#P<0.05vsnormal group.

图3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln的表达及分布变化

Figure 4.The plasma LPS concentration (A) and 24 h urinary lactulose/mannitol ratio (B) of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

图4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血浆LPS浓度及尿液乳果糖/甘露醇比值的变化

在本研究中，我们发现DM小鼠IECs中miR-429的表达较正常小鼠显著升高，而且经生物信息学预测，Ocln可能为miR-429的调控靶点，为了进一步研究DM小鼠IECs中上调的miR-429与Ocln的表达及肠屏障功能的的关系，根据文献[12]的方法我们构建了一种经特殊化学修饰的miR-429的拮抗剂——antagomiRNA-429，经尾静脉注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429的表达明显下调，并且在注射后第6天恢复至正常小鼠的水平。在注射后第6天，DM小鼠IECs中Ocln的mRNA和蛋白表达均明显升高，提示DM小鼠中miR-429表达上调可抑制Ocln的表达。

LPS普遍存在于革兰氏阴性菌的菌壁中，在细菌受损或死亡时被释放出来。众所周知，人和动物肠道中均存在大量的细菌，这些细菌在受损或死亡时也会释放出大量的LPS，在正常状态下受制于肠屏障作用，仅有极少量LPS能透过肠上皮入血，而肠上皮细胞间紧密连接在此起着十分重要的作用。病理状态下，肠上皮细胞间紧密连接受损导致肠屏障功能障碍，肠腔中的LPS经肠上皮细胞间隙大量入血，引起内毒素血症，造成全身各器官组织损害。在过去的研究中[4]，我们发现DM小鼠肠道中需氧菌与厌氧菌的数量与正常小鼠并无显著差异，因此，血浆LPS浓度可作为反映肠屏障功能改变的一个可靠指标。另外，在肠道中甘露醇是经细胞途径吸收，而乳果糖是经细胞间途径吸收，即通过细胞间紧密连接被动吸收，两者均不易代谢而经肾脏排出。正常情况下乳果糖只有少量吸收入血，而在肠上皮细胞间紧密连接受损时，乳果糖大量吸收入血并从肾脏排出，而甘露醇的吸收基本不受影响，因此测定小鼠尿液中乳果糖/甘露醇比值是检测小鼠肠道通透性的一个常用而可靠的指标。在本研究中，我们发现DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值和血浆LPS浓度均显著高于正常小鼠，而且经注射antagomiRNA-429后，DM小鼠中这2个指标均明显降低，但仍高于正常小鼠水平，提示其肠屏障功能得以部分恢复，同时，这也反映了miR-429的高表达是造成DM小鼠肠屏障功能障碍的一个重要原因。

值得注意的是，尽管应用antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs内miR-429表达后，Ocln表达明显升高，但其水平仍低于正常水平(P<0.05)，提示其表达还受到其它因素的调节，如炎症因子、其它microRNA等，据我们所知，过去在这方面的研究主要集中在炎症性肠病、肠易激综合征、酒精性肝病等方面[9, 13-14]，而在糖尿病肠病中的研究少之又少。另一方面，虽然应用antagomiRNA-429后DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值以及血浆LPS水平均明显降低了，但仍明显高于正常小鼠的水平，提示肠屏障功能并未完全恢复，究其原因，一方面可能是Ocln的表达同时还受到一些其它因素的影响，另一方面，其它紧密连接相关蛋白如ZO-1、Claudins、JAM等的表达也可能发生变化，从而影响肠屏障功能，因此，这方面的变化及其机制尚需进一步探索。

综上所述，本研究首先发现了DM小鼠IECs内miR-429表达上调，并在体内应用antagomiRNA-429有效降低其表达水平, 进而使小鼠IECs内Ocln的表达升高，肠上皮屏障功能得到部分恢复，证实miR-429表达上调与DM小鼠肠上皮屏障功能障碍密切相关。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effect of targeted inhibition of occludin by microRNA-429 on intestinal epithelial barrier function in diabetic mouse

LU Xi-ji, YU Tao, XIA Zhong-sheng△, SHAN Ti-dong, OUYANG Hui, XU Ji-hao, CHEN Qi-kui

(DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xiazhsh@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-429 (miR-429) on the expression of occludin (Ocln) in intestinal epithelial cells (IECs) and intestinal epithelial barrier function in diabetic mice. METHODS: Diabetes mellitus mouse model was induced by intraperitoneal injection of streptozocin. The expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was inhibited by antagomiRNA-429 injected via tail vein. The expression of miR-429 and mRNA expression of Ocln were detected by real-time PCR. The protein expression of Ocln was determined by Western blotting and immunohistochemistry. The urinary lactulose/mannitol ratio was measured by gas chromatography. The plasma LPS concentrations in the mice were measured by chromogenic end-point TAL kit. RESULTS: The results of real-time PCR confirmed that the expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was remarkably inhibited by tail-vein administration of antagomiRNA-429, and resumed to similar level of normal mice on the 6th day after the administration. After suppressing the level of miR-429, the expression of Ocln in IECs of diabetic mice increased significantly (P<0.05), while the urinary lactulose/mannitol ratio and the plasma LPS concentration decreased obviously (P<0.05). CONCLUSION: AntagomiRNA-429 effectively suppresses miR-429 expression in IECs of diabetic mice, and then enhances the expression of Ocln and partially resumes the intestinal epithelial barrier function.

Diabetes mellitus; microRNA-429; Occludin; Intestinal epithelial barrier function

1000- 4718(2016)04- 0696- 05

2015- 11- 09

2016- 01- 20

国家自然科学基金资助项目(No. 81370475)

Tel: 86-20-81332598; E-mail: xiazhsh@163.com

R363.2; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.019

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