幸仁忠，　刘建军，　许　华△，　杨细飞△

(1暨南大学药学院，广东 广州 510632； 2深圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室, 广东 深圳 518055)



TRPC1缺失对小鼠脑神经细胞生存的影响*

幸仁忠1，刘建军2，许华1△，杨细飞2△

(1暨南大学药学院，广东 广州 510632；2深圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室, 广东 深圳 518055)

目的：研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)缺失对小鼠海马神经元生存的影响。方法: 选用6月龄TRPC1基因敲除小鼠及其对照小鼠，通过神经元特异性标志物NeuN免疫染色、尼氏染色及TUNEL染色检测TRPC1敲除小鼠海马CA1、CA3及齿状回(DG)神经细胞的变化情况。通过Western blot检测TRPC1基因敲除小鼠促凋亡因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达水平。结果: NeuN免疫荧光和尼氏染色发现，TRPC1基因敲除小鼠海马CA1、CA3及DG区神经细胞显著减少;TUNEL染色检测发现TRPC1基因敲除小鼠以上区域神经细胞凋亡显著增加；Western blot结果显示，与对照小鼠相比，TRPC1基因敲除小鼠海马组织CHOP及cleaved caspase-3的水平均显著升高。结论:TRPC1基因缺失可导致小鼠海马神经元数量显著减少，其机制可能与TRPC1缺失促进神经细胞凋亡有关。

瞬时受体电位通道1； 神经元； C/EBP同源蛋白； Caspase-3

瞬时受体电位蛋白(transient receptor potential，TRP)是一跨膜蛋白，根据氨基酸序列的同源性和功能倾向性不同，可分为TRPC、TRPV、 TRPM、TRPP、 TRPML和TRPA 6种蛋白家族。TRPC即经典的TRP通道，TRPC 亚家族包括7个亚型(TRPC1～TRPC7)[1]，TRPC1是第1个在哺乳动物发现的TRP。TRPC1在脑、骨骼肌、心脏、肾脏、皮肤、睾丸、卵巢、前列腺和肺都检测到其高表达[2]。

TRPC1是一种非选择性阳离子通道，其主要功能是维持体内Ca2+稳态[3]。尽管TRPC1缺陷小鼠可以生存到成年，但很多器官和组织发生缺陷，如心脑血管、中枢神经、骨骼、肌肉和免疫系统。细胞增殖依赖于细胞内Ca2+浓度，细胞内Ca2+浓度在细胞凋亡中起着重要的作用。TRPC1敲除诱导细胞周期停留在G0/G1期[4]。TRPC1可以促进神经元突触的生长，对神经元有保护作用[5]。TRPC1与很多神经系统疾病相关，如帕金森病和神经源性炎症[6-7]。TRPC1蛋白分布于哺乳动物颞叶结构，且神经元选择性地表达TRPC1，表明其可能有助于神经元存活[8]。然而，TRPC1缺失是否影响小鼠海马神经细胞存活尚未见报道。本研究通过多种方法对神经细胞进行染色，并检测促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和cleaved caspase-3的表达水平来研究TRPC1缺失对小鼠神经细胞生存的影响。

材　料　和　方　法

6月龄野生对照(129SvEv)小鼠及TRPC1基因敲除小鼠(Trpc1-/-小鼠)，野生对照小鼠从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，Trpc1-/-小鼠由美国国家环境卫生科学研究院Lutz Birnbaumer教授馈赠。

2主要试剂与仪器

神经元特异性标志物NeuN、CHOP、cleaved caspase-3 I抗均购自CST；β-actin I抗购自Santa Cruz；引物购自生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix和 SYBR® Premix Ex TaqTM购自TaKaRa；尼氏染色液购自碧云天公司；DeadEndTMFluorometric TUNEL System购自Promega；激光共聚焦显微镜为Leica TCS SP5；普通显微镜为Olympus BX60；荧光显微镜为Olympus ⅠX 51。

3主要方法

3.1免疫荧光用3%的水合氯醛麻醉小鼠，心脏灌注后于4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖中脱水48 h直到组织沉到底部，OCT包埋后于切片机中切片(15 μm)。冰冻切片于0.3% Triton X-100室温孵育15 min，3% BSA封闭30 min，Ⅰ抗中过夜，Ⅱ抗孵育1 h，DAPI室温孵育后加抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜下观察和采集图片，用Image J软件统计阳性神经细胞数量。

3.2尼氏染色冰冻切片于蒸馏水中漂洗2 min，尼氏染色液染色10 min,染色温度为50 ℃。蒸馏水洗涤2次，95%乙醇中分色20 s，无水乙醇脱水10 min，二甲苯透明后用中性树脂封片。在普通显微镜Olympus BX60下观察组织。

3.3TUNEL染色石蜡切片，56℃烘箱中放置1 h熔蜡，二甲苯脱蜡5 min 3次，乙醇梯度脱水，用蛋白酶K通透组织切片，加平衡缓冲液后盖上塑料盖玻片，加入孵育缓冲液(内含平衡缓冲液，核苷混合物和rTdT酶)，盖上塑料盖玻片，并于37°C孵育1 h，避免光照。移除塑料盖玻片，将载玻片浸入2×SSC，1×PBS洗5 min 3次后加DAPI，抗荧光淬灭剂封片后，用荧光显微镜在蓝光下检测定位凋亡细胞的绿色荧光(荧光素-12-dUTP)。

3.4Western blot检测凋亡相关蛋白取25 μg 蛋白经10% SDS-PAGE分离。将凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，Ⅰ抗中4 ℃过夜，TBST漂洗PVDF 膜10 min 3次，取出PVDF膜加入Ⅱ抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ⅱ抗1∶3 000， 羊抗兔Ⅱ抗1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜后曝光。

为测试用户操作软件的性能，在泳池环境下进行测试。图5是泳池环境下的ROV，图6是自动检测界面，图7是主操作界面。

4统计学处理

实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示，应用Graph Pad Prism 6.0软件对组间差异进行t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1TRPC1缺失导致海马NeuN阳性神经细胞数量减少

免疫荧光染色发现，Trpc1-/-小鼠CA1、CA3和齿状回(dentate gyrus, DG)区神经细胞较野生型小鼠显著减少(P<0.05)，见图1。

2TRPC1缺失诱导神经元显著减少

居氏染色结果提示：和野生型小鼠相比，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG区的神经元减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3TRPC1缺失诱导海马神经细胞凋亡显著增加

为了确定TRPC1缺失是否诱导神经细胞凋亡，我们对小鼠海马进行TUNEL染色。蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表凋亡细胞，统计结果显示，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG区神经细胞凋亡显著增加(P<0.05),见图3。

4TRPC1缺失诱导凋亡蛋白活化

促凋亡蛋白CHOP和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3在Trpc1-/-小鼠海马中的水平显著增加(P<0.05)，见图4。

Figure 1.TRPC1 depletion causes neuronal loss. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

图1NeuN染色检测神经细胞数量

Figure 2.TRPC1 depletion reduced the number of neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

图2尼氏染色检测神经细胞数量

Figure 3.The effects of TRPC1 depletion on apoptosis in hippocampus. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

图3TUNEL染色检测神经细胞凋亡的变化

Figure 4.The effects of TRPC1 depletion on the levels of CHOP and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsWT.

图4Western blot分析促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3水平

讨　　论

内质网是储存Ca2+的重要细胞器，内质网对维持细胞内Ca2+稳态起重要作用。内质网Ca2+稳态主要受2方面的影响：Ca2+诱发性钙释放 (calcium-induced calcium release, CICR)和钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry, SOCE)。CICR诱导Ca2+从钙库释放到胞浆；细胞内Ca2+的水平发生变化时，尤其是内质网内Ca2+的浓度下降时，间质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)被激活并转移到质膜上，与TRPC1结合激活钙库操纵性钙通道(store-operated Ca2+channels, SOCC)，产生SOCE促进Ca2+内流，从而增加内质网Ca2+的浓度[9-10]。细胞内Ca2+水平的失衡是诱发细胞凋亡相关信号转导的刺激因子。Ca2+诱导细胞凋亡的调节机制有：(1)调节线粒体渗透性而参与细胞凋亡[11]，激活哺乳动物线粒体的膜通道PTP，使得相对分子量低的分子通透性突然增大，释放一些小分子如细胞色素C、Ca2+、凋亡诱导因子等，这些物质可以直接或间接引起细胞凋亡;(2)Ca2+可调节磷脂酶活性，磷脂酶的激活与Ca2+启动的细胞凋亡有关[12]。

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下遵循自己的生命程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解成若干凋亡小体被其它细胞吞噬[12]。本研究发现TRPC1基因敲除小鼠的神经细胞数量较野生型小鼠显著减少，促凋亡蛋白CHOP和激活的caspase-3水平均显著升高，提示TRPC1缺失可导致神经细胞凋亡。TRPC1敲除可直接或间接破坏线粒体，导致内质网Ca2+消耗和激活未折叠蛋白应答(unfolded protein response, UPR)，内质网Ca2+消耗导致内质网Ca2+平衡被破坏，最终导致内质网应激[13]。UPR的活化可帮助机体抵抗内质网应激，但持续性的未折叠蛋白应答导致内质网的生理机制不能恢复正常，最终触发细胞程序性死亡[14]。Casapse-3是执行凋亡的关键分子之一，通过蛋白酶解加工分解成有活性的片段p12和p17。研究表明内质网应激时，促凋亡蛋白CHOP的表达水平增加并介导细胞程序性死亡[15]。因此TRPC1缺失导致小鼠脑神经细胞丢失可能是通过内质网应激导致促凋亡蛋白CHOP的表达水平增加导致的。

综上所述，本研究通过多种染色方法证实TRPC1缺失可导致小鼠海马神经细胞丢失，其机制可能是由于TRPC1缺失，导致内质网钙紊乱，激发内质网应激，引起促凋亡因子CHOP表达上调及凋亡蛋白caspase-3激活，最终使神经细胞凋亡。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Effect of TRPC1 depletion on survival of cerebral nerve cells

XING Ren-zhong1, LIU Jian-jun2, XU Hua1, YANG Xi-fei2

(1CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2KeyLaboratoryofModernToxicologyofShenzhen,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China.E-mail:huax_mail@126.com;E-mail:xifeiyang@gmail.com)

AIM: To study the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) on the survival of hippocampal neurons in mice.METHODS:TRPC1 knockout mice and the control mice (6 months old) were used in this study. Immunofluorescence staining of neuron-specific marker NeuN, Nissl staining and TUNEL staining were performed to measure the changes of the neurons in hippocampal CA1, CA3 and dentate gyrus (DG). Western blot analysis was used to detect the levels of pro-apoptotic protein C/EBP homologous protein (CHOP) and cleaved caspase-3.RESULTS: Immunofluorescence staining and Nissl staining showed that the number of neuronal cells was significantly decreased in hippocampal CA1, CA3 and DG ofTRPC1 knockout mice compared with the control mice. TUNEL staining showed that the apoptosis neuronal cell number of the above areas inTRPC1 knockout mice was significantly increased compared with the control mice. The results of Western blot revealed that the levels of CHOP and cleaved caspase-3 were significantly increased in the hippocampus ofTRPC1 knockout mice relative to the control mice. CONCLUSION: The depletion of TRPC1 induces neuronal loss through a mechanism of TRPC1-mediated apoptosis.

Transient receptor potential channel 1; Neuron; C/EBP homologous protein; Caspase-3

1000- 4718(2016)04- 0686- 05

2015- 11- 20

2016- 02- 26

广东省自然科学基金资助项目(No. 2014A030313715);深圳市科技研发基金基础研究项目(No. JCYJ20130329103949650)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.017

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△通迅作者 许华 Tel: 020-38375022; E-mail: huax_mail@126.com; 杨细飞 Tel: 0755-25601914; E-mail: xifeiyang@gmail.com