李若彤，　王　丽，　曹　亭，　陈圣文，　费洪荣，　王凤泽△

(1泰山医学院基础医学院，山东 泰安 271000； 泰山医学院 2生命科学学院， 3药学院,山东 泰安 271016)



Perifosine通过抑制PI3K/Akt途径调节人胶质瘤U251细胞增殖、凋亡与自噬*

李若彤1，王丽2，曹亭2，陈圣文2，费洪荣3，王凤泽2△

(1泰山医学院基础医学院，山东 泰安 271000； 泰山医学院2生命科学学院，3药学院,山东 泰安 271016)

目的： 探讨Akt激酶抑制剂perifosine对人胶质瘤U251细胞凋亡、细胞周期和自噬的影响，确定perifosine诱导的细胞自噬与其促进胶质瘤细胞凋亡的相关性。方法：Perifosine处理U251细胞后，采用MTT法检测细胞活力；流式细胞术分析perifosine对U251细胞周期的影响；Annexin V-FITC/PI双标法检测perifosine对胶质瘤细胞凋亡的作用；免疫印迹法检测细胞内P21、P27和cyclin B1等细胞周期调控相关蛋白以及caspase-9、PARP等细胞凋亡相关蛋白的表达水平；通过观察细胞内自噬标志分子LC3-II的分布与表达来确定perifosine对自噬的诱导作用。结果：Perifosine剂量依赖性地抑制U251细胞活力，能够通过抑制cyclin B1的表达而阻滞胶质瘤细胞周期于G2期。Perifosine促进了U251细胞内caspase-9和PARP的剪切，抑制survivin表达，从而诱导胶质瘤细胞发生凋亡。同时，perifosine与自噬抑制剂氯喹联用后，U251细胞凋亡数量明显增加。结论：Perifosine能够抑制U251细胞的增殖，同时诱导细胞发生凋亡与自噬，抑制自噬促进了perifosine诱导的胶质瘤细胞凋亡。

Perifosine； Akt； 胶质瘤； 细胞凋亡； 自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路广泛参与调控细胞的增殖、存活和分化等生理病理活动。由于11该信号途径上游抑制因子PTEN 的突变，或者PI3K基因的扩增及Akt 的过度活化，导致PI3K/Akt 信号通路在人类肿瘤谱中广泛失调[1-2]。因此，抑制该通路可能成为恶性肿瘤治疗的有效手段。Perifosine是新型的烷基磷脂类化合物，主要通过调节PI3K/Akt 和MAPK 等信号通路发挥抗肿瘤作用[3-4]。我们在前期研究发现perifosine能够抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖并诱导其凋亡，表现出良好的体外抗肿瘤活性[5]。本研究以人胶质瘤细胞系U251为实验材料，探讨perifosine抑制细胞增殖的分子机理，在观察perifosine对U251细胞凋亡和自噬影响的同时，分析perifosine诱导细胞自噬与其促进U251细胞凋亡的相关性。

材　料　和　方　法

1实验材料

Perifosine购自Selleck Chemicals；胎牛血清购自Gibco；MTT、氯喹(chloroquine，CQ)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、β-actin抗体和LC3-Ⅱ抗体购自Sigma；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD Biosciences；Akt抗体、caspase-9 抗体、PARP抗体、survivin抗体和Cdc2抗体购自CST；CyclinB1抗体购自Santa Cruz；P21抗体和P27抗体购自BD Biosciences；p-Akt 抗体购自Abcam；II 抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL化学发光检测试剂盒购自Thermo。

2实验方法

2.1细胞培养人胶质瘤细胞株U251购自上海中科院细胞库，在37 ℃、5% CO2条件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM 培养基培养。

2.2MTT实验检测细胞活力胰酶消化U251细胞并接种于96孔板中，过夜培养后加入不同剂量的perifosine 处理24 h，对照组加入PBS。终止培养前4 h，加20 μL MTT(5 g/L)于各个孔中。吸去培养基，加入150 μL二甲基亚砜，室温振荡10 min，490 nm波长下测定各孔吸光度值。实验重复3次。

2.3流式细胞术检测细胞周期不同浓度的perifosine作用细胞24 h后，胰酶消化并制备单细胞悬液，然后加入预冷的75%无水乙醇于4 ℃固定18 h。接着用PBS洗涤细胞2次，加入终浓度为50 mg/L RNase A于37 ℃孵育30 min；加入终浓度为50 mg/L的PI于4 ℃闭光染色20 min，然后上机检测分析各组细胞的周期分布。实验重复3次。

2.4细胞凋亡的检测采用Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡，具体操作方法参照试剂盒说明书进行，根据Annexin V-FITC/PI的荧光强度计算细胞凋亡百分率。实验重复3次。

2.5免疫印迹实验细胞经不同剂量perifosine处理24 h后，进行免疫印迹分析。各组细胞经PBS洗涤2次后，用预冷的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min，然后4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清并用BCA 法定量。经SDS-PAGE分离蛋白，将凝胶上的蛋白质电转至硝酸纤维素膜上；再用5%脱脂奶粉封闭过夜，加入 I 抗，室温孵育3h后加入 II 抗，最后ECL 发光液曝光显影。实验重复3次。

2.6细胞内GFP-LC3 融合蛋白的表达接种U251细胞于6 孔板中，待细胞融合至80% 左右用Lipofectamine 2000 转染GFP-LC3 质粒。转染24 h 后，加入不同浓度的perifosine 继续处理24 h，倒置荧光显微镜下观察并拍照。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白一般呈弥散状态分布于胞浆中，当细胞发生自噬时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成明亮的绿色斑点(相当于自噬体)。

3统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结　　果

1Perifosine抑制U251细胞内Akt的磷酸化

Akt 第473 位点丝氨酸磷酸化(p-AktS473)增强通常被作为Akt激活的指标。由于perifosine是Akt 的抑制剂，所以本研究首先检测了perifosine对U251细胞内Akt 磷酸化(p-AktS473)的抑制作用。免疫印迹结果显示经perifosine处理24 h后，细胞内Akt的磷酸化水平显著受到抑制，且抑制作用呈剂量依赖性。细胞内总Akt 的表达量无明显变化,见图1。

2Perifosine阻滞U251细胞于G2期

用MTT法检测了perifosine作用24 h 后对U251细胞活力的影响。结果显示perifosine可显著抑制U251细胞活力，且抑制作用呈剂量依赖性,见图2。用流式细胞术分析了perifosine对U251细胞周期的影响，结果如图3和表1所示，perifosine处理24 h后，处于G2期的细胞数量明显增多，表明perifosine能够诱导细胞发生G2期阻滞。

Figure 1.The protein levels of p-Akt and total Akt in the U251 cells treated with perifosine for 24 h determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图1Perifosine 抑制U251细胞内Akt的磷酸化

Figure 2.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the viability of the U251 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图2Perifosine抑制U251细胞活力

免疫印迹实验结果表明，perifosine抑制胶质瘤细胞中P27和cyclin B1的表达，而P21的蛋白水平则随着perifosine的浓度增加而上调，但Cdc2的表达水平无明显变化,见图4。

3Perifosine 诱导U251细胞发生凋亡

诱导肿瘤细胞发生凋亡如同抑制细胞增殖一样，也是小分子药物抗肿瘤作用的重要理论依据。因此，我们采用Annexin V-FITC/PI双标法检测perifosine对胶质瘤细胞凋亡的影响。如同对SGC-7901胃癌细胞凋亡的诱导作用，较高浓度的perifosine同样促进了胶质瘤细胞U251发生凋亡,见表2。

免疫印迹法检测了perifosine对U251细胞内凋亡相关蛋白活性及表达水平的影响。发现较高浓度的perifosine促进了胱天蛋白酶家族成员caspase-9和PARP的切割，而凋亡抑制蛋白survivin的表达则逐渐降低，见图5。

Figure 3.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhiibted G2phase arrest.

图3Perifosine诱导U251细胞阻滞于G2期

表1Perifosine诱导U251细胞周期阻滞于G2期

Table 1.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhi-bited G2phase arrest (%. Mean±SD.n=3)

Perifosine(μmol/L)G0/G1SG2/M066.86±3.7518.53±1.5114.27±1.38559.26±3.77*17.89±1.6323.68±1.82*1041.31±2.93*18.03±1.8739.20±2.49*

*P<0.05vs0 μmol/L.

4Perifosine抑制U251细胞发生自噬

转染GFP-LC3质粒的胶质瘤细胞经perifosine处理24 h 后，GFP-LC3 细胞内的点状分布增加，证实perifosine能够促进胶质瘤细胞自噬的发生,见图6。同时，免疫印迹法检测perifosine对人胶质瘤细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达的影响，发现不同浓度的perifosine处理细胞后，LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显增多，进一步证明perifosine能够诱导U251细胞发生自噬,见图7。

Figure 4.The effects of perifosine treatment at different concentrations for 24 h on the expression of cell cycle-associated proteins in the U251 cells. Cell lysates were analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图4Perifosine对细胞周期相关蛋白表达水平的影响

表2　Perifosine 促进U251细胞发生凋亡

*P<0.05vs0 μmol/L.

5抑制自噬促进perifosine诱导的U251细胞凋亡

CQ是特异性自噬抑制剂，主要抑制细胞内自噬体和溶酶体的融合[6]。U251细胞经CQ(10 μmol/L)与perifosine(20 μmol/L)联合作用24 h后，Annexin V-FITC/PI双标法检测了细胞凋亡的变化。结果表明抑制自噬促进了perifosine诱导的U251细胞凋亡，见表3。同时免疫印迹结果显示，自噬抑制剂CQ与perifosine 联用促进了PARP的切割，见图8。

Figure 5.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the levels of apoptosis-related proteins in the U251 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图5免疫印迹检测perifosine对U251细胞内凋亡相关蛋白的影响

Figure 6.Representative images of GFP-LC3 in the U251 cells transfected with GFP-LC3 plasmid. After transfection for 24 h, the cells were treated with perifosine for another 24 h.

图6Perifosine对U251细胞GFP-LC3融合蛋白表达的影响

讨　　论

胶质瘤是成人常见的恶性脑肿瘤，其侵袭性强，术后复发率高。尽管治疗手段不断进步，但中位生存期仍无明显改进。目前胶质瘤的治疗以手术治疗为主，化疗则是常规的辅助治疗方法，但化疗药物的获得性耐药使得化疗效果较差，因此迫切需要寻找新的药物来辅助胶质瘤的手术治疗。PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，通过调节细胞周期和细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能。研究发现，PI3K/Akt信号途径在胶质瘤中过度活化[7-8]，提示该通路与胶质瘤的发生发展关系密切，而PI3K和Akt激酶或许成为胶质瘤临床治疗的有效靶点。

Perifosine作为新型的Akt抑制剂，能够通过抑制Akt和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化而抑制小鼠胶质祖细胞的增殖[9]。本研究以U251胶质瘤细胞为实验材料，主要探讨Akt抑制剂perifosine对U251细胞增殖、凋亡和自噬的影响。我们发现，perifosine能够阻滞细胞于G2期而抑制增殖；通过促进caspase-9和PARP的切割，抑制survivin的表达而诱导细胞凋亡。细胞增殖失控是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而细胞周期调控紊乱是增殖失控的根本原因。因此，调控细胞周期进程与诱导细胞凋亡或坏死一样已成为肿瘤治疗的重要途径之一。细胞周期蛋白是真核细胞周期进程的主要调节蛋白，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)结合形成cyclin-CDKs 复合物共同调控着细胞周期[10]。当肿瘤细胞经药物或辐射处理后，通常出现G1/S期或G2/M期阻滞，以便修复受损的DNA。Cdc2/cyclin B1作为G2期检验点的重要开关，与Cdc25C相互作用于细胞周期，开启细胞有丝分裂进程[11]。本研究用perifosine处理U251细胞后，cyclin B1的蛋白水平下调，使Cdc2/cyclin B1 复合物的活性降低，从而发生G2期阻滞。

Figure 7.The effect of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the expression of LC3-II in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图7Perifosine对U251细胞中LC3-II表达的影响

表3抑制自噬增强perifosine诱导的U251细胞凋亡

Table 3.The effects of autophagic inhibitor chloroquine (CQ) on perifosine-induced cell apoptosis (Mean±SD.n=3)

TreatmentEarlyapoptoticrate(%)Lateapoptoticornecroticrate(%)Control1.36±0.644.25±1.33Perifosine5.03±1.95*5.80±2.17CQ2.53±0.866.38±1.75Perifosine+CQ12.07±3.72*#11.40±3.69*#

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

Figure 8.U251 cells were treated with 20 μmol/L perifosine and/or with 10 μmol/L CQ for 24 h, and the protein level of cleaved PARP was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

图8CQ抑制自噬增强perifosine诱导的PARP切割

细胞自噬是真核细胞所特有的一种胞内代谢途径，细胞通过自我消化折叠错误的蛋白质或受损的细胞器，为机体提供物质能量从而保证大分子的合成[12]。自噬与肿瘤的发生、发展密切相关。有研究证明自噬能够诱导肿瘤细胞发生非凋亡途径的细胞死亡；但越来越多实验发现自噬不但能够为肿瘤细胞提供能量，促进肿瘤细胞存活，而且与肿瘤细胞的化疗耐药性相关[13-15]。当用化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡时，细胞自噬活性增强，产生耐药性，而与自噬抑制剂联用能够减弱这种耐药性[16]。本研究中，我们观察了perifosine对U251细胞自噬的影响，发现perifosine促进了U251细胞发生自噬，抑制自噬增强了perifosine诱导的U251细胞凋亡，表明perifosine诱导的U251细胞自噬对细胞是保护性的。

总之，perifosine能够诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬。抑制自噬增强了perifosine诱导的U251细胞凋亡，本研究为胶质瘤的临床辅助治疗提供了新的策略。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Perifosine regulates human brain glioma U251 cell proliferation, apoptosis and autophagy through suppression of PI3K/Akt pathway

LI Ruo-tong1, WANG Li2, CAO Ting2, CHEN Sheng-wen2, FEI Hong-rong3, WANG Feng-ze2

(1SchoolofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China;2SchoolofLifeSciences,3SchoolofPharmaceuticalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China.E-mail:wfz221@sina.com)

AIM: To investigate the effect of perifosine, an inhibitor of protein kinase B (PKB/Akt), on the cell cycle, apoptosis and autophagy in human brain glioma U251 cells, and to determine the relationship between perifosine-induced autophagy and apoptosis of glioma. METHODS: The cell growth inhibition was determined by MTT assay. The cell cycle distribution of U251 cells was examined by flow cytometry. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC apoptosis detection kit. The protein expression of P21, P27, cyclin B1, caspase-9 and PARP was examined by Wes-tern blot analysis. The distribution and expression of LC3-II, an autophagy marker, was observed to determine the effect of perifosine-induced autophagy. RESULTS: Perifosine inhibited the cell viability in a dose-dependent manner. In perifosine-treated U251 cells, the cell cycle was arrested in G2phase and the expression of cyclin B1 was inhibited. Perifosine induced apoptosis of U251 cells through activation of caspase-9 cleavage, PARP cleavage and survivin inhibition. In addition, suppression of autophagy by chloroquin, an inhibitor of autophagy, increased the number of apoptotic cells. CONCLUSION: Perifosine inhibits cell proliferation and triggers apoptosis and autophagy in human U251 cells. Blocking autophagy magnifies perifosine-induced glioma cell apoptosis.

Perifosine; Akt; Glioma; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2016)04- 0644- 07

2015- 10- 27

2015- 12- 31

国家自然科学基金资助项目(No.81272683)；山东省高等学校科技计划项目(No.J15LM09)

Tel: 0538-6236991； E-mail: wfz221@sina.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.011

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