宋学莲，　齐晓勇，　党　懿，　李英肖，　杨　倩

(河北医科大学附属河北省人民医院心内科，河北 石家庄 050000)



阿托伐他汀对快速起搏兔房颤模型心房电重构的影响

宋学莲，齐晓勇△，党懿，李英肖，杨倩

(河北医科大学附属河北省人民医院心内科，河北 石家庄 050000)

目的： 观察阿托伐他汀(ATO)对快速起搏兔房颤模型心房电重构、心房肌离子通道蛋白及心脏功能的影响，探讨阿托伐他汀防治心房颤动的电生理机制。方法: 30只新西兰大白兔开胸植入心房起搏和测试电极，采用特制动物心脏起搏器快速起搏心房的方法建立兔房颤模型，将其分为对照组、起搏组和药物组。药物组预先给予阿托伐汀钙片2 mg·kg-1·d-1灌胃7 d，起搏组和药物组快速起搏心房48 h，期间药物组持续给药处理，分别于0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h测量心房有效不应期，计算心房频率适应性，观察心脏大小及心功能的变化，比较各组心房肌细胞离子通道蛋白CaLα1和Kv4.3的表达差异。结果: 与对照组相比，药物组和起搏组心房有效不应期缩短，频率适应性下降，心房肌细胞离子通道蛋白CaLα1及Kv4.3表达水平降低(P<0.05)，其中以起搏组变化最为明显。快速起搏心房48 h后，起搏组和药物组左房较对照组增大(P<0.05)，而左心室大小及射血分数起搏前后均无明显差异。结论: 短期快速心房起搏可引起心房有效不应期缩短，导致心房频率适应性不良，阿托伐他汀预处理可有效改善快速起搏诱导的兔心房电重构，而对心脏结构影响不大。进一步研究发现阿托伐他汀可在一定程度上抑制心房肌钾、钙离子通道蛋白水平降低，这可能是其改善电重构的机制之一。

心房颤动； 阿托伐他汀； 电重构

他汀类药物即羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，其降低胆固醇、调脂稳定斑块的作用已广泛应用于临床，可明显降低心血管事件的发生，在冠心病的一级、二级预防中有着重要的作用。随着基础实验的深入和临床实验的开展，人们发现使用他汀类药物在其降脂作用尚未显现时即可产生获益，提示他汀类药物有独立于降脂之外的作用，称之为他汀的多效性。近年来对于他汀在房颤防治方面的作用研究较多，但是并无明确结论，尤其是他汀对于房颤电生理方面影响的机制争论较多。本研究通过建立心房快速起搏(atrial tachypacing, ATP)兔模型，模拟房颤状态，观察阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)对快速起搏兔心房有效不应期及心房肌细胞离子通道的变化，探讨其影响心房电重构的机制。

材　料　和　方　法

1动物和材料

选用雄性新西兰大白兔30只作为实验对象，体重2.5～3.0 kg，由河北医科大学动物实验中心提供；动物心脏起搏器型号为FDM30，起搏电压5 V，脉冲频率600 min-1；ATO钙片为辉瑞制药有限公司产品；抗L型钙离子通道α1亚单位CaLα1、抗钾离子通道Kv4.3和内参照β-actin抗体均购自北京博奥森公司。采用Philips IU22超声诊断仪测定各项心脏超声指标；用苏州东方DF-5A型电生理刺激仪测定电生理指标。

2实验方法

2.1兔房颤模型建立将实验动物随机分为对照组，即非起博(nonpacing，NP)组、ATP组和ATO药物组，每组各10只。对照组和房颤组的动物术前7 d给予生理盐水10 mL/d灌胃，ATO组给予ATO钙片2 mg·kg-1·d-1(溶于10 mL生理盐水)灌胃，后续处理期间持续给药。灌胃7 d后制作房颤模型。3%戊巴比妥钠以1 mL/kg经耳缘静脉麻醉家兔后，仰卧位固定于手术台上，备皮，于胸骨左缘第3、4肋间区，打开胸腔，暴露心脏，找到左心房，将起搏电极与测试电极并列与左心耳结扎，引出电极，关闭胸腔，将电极沿皮下隧道引导至右腋后区，应用电生理刺激仪分别测试2条电极，保证裸露导线与心房肌接触良好，且与胸壁绝缘。于家兔脊柱旁侧制作起搏器囊袋，庆大霉素2×104U冲洗囊袋，连接起搏电极与动物起搏器并固定，测试电极固定于皮下，留待电生理指标测定。

2.2电生理指标测定造模动物休息3 d后，动物起搏器以600 bpm发放脉冲刺激起搏组与药物组，对照组不给予刺激，分别于刺激0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h测定心房有效不应期(atrial effective refractory period，AERP)，计算心房频率适应性。测定方法：(1)AERP：应用心脏电生理刺激仪连接测试电极，采用S1S2程控刺激方案，分别以150 ms和200 ms两个基础周长进行S1S2负扫描，S1S2呈8∶1，递减步长为5 ms，以S2后不能下传心房的最长间期为有效不应期，分别记为AERP150和AERP200，分别测量3次，取平均值。(2)AERP频率适应性:以AERP200-AERP150表示，正常表现为随起搏周长延长而延长，其差值越大反映心房适应功能越好，反之则适应功能不良。

2.3心脏超声指标测定应用超声诊断仪于动物心脏起搏器刺激前后行经胸无创心脏超声检查，在二维超声引导下取左室长轴切面，在M型图像上，采用Teichbolz法测量左房长轴(left atrial dimension，LAD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)和左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

2.4心房肌细胞离子通道蛋白的测定依据实验分组在实验结束后麻醉家兔，无菌技术开胸，迅速取出心脏，在无菌生理盐水中漂洗心脏，剪下左心房，分别剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌组织总蛋白，Bradford比色法测定抽提蛋白的浓度。按照说明书标准操作步骤，蛋白样品与4×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合后电泳，然后采用半干转的方法转移到PVDF膜，PVDF膜经5%BSA封闭2 h，于经PBS稀释的Ⅰ抗工作液中4 ℃反应过夜，在经1×PBST稀释3 000倍的Ⅱ抗工作液中处理90 min，蛋白条带通过显影定影液显色后，采用UVP分析仪器，对胶片进行扫描，然后括住每一个条带，系统自动生成灰度值。

纳入标准：（1）根据 2012 年中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制定的 IBD 诊断标准确诊为IBD者，患者的认知功能正常；（2）能够配合研究和完成问卷测查。且本研究患者均知情同意并经过医院伦理委员会批准。

3统计学处理

应用SPSS 13.0 统计学分析软件对数据进行分析，结果数据用均数±标准差(mean±SD)表示；各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1动物存活情况

对照组家兔因手术死亡2只，起搏组和药物组各有2只因起搏电极脱位未完成实验而剔除。

2AERP的变化

不同起搏周长下，3 组基础AERP间的差异无统计学显著性，在快速起搏8 h后，起搏组AERP150较起搏前缩短6.49 ms，较对照组缩短7.74 ms(P<0.05)，随着起搏时间延长，AERP150进行性缩短，至起搏48 h后缩短程度达20%以上。药物组AERP150缩短程度较起搏组轻，心房快速起搏48 h后平均共缩短15.0 ms，缩短程度15.15%，与对照组相应时点相比差异有统计学显著性(P<0.05)。调整起搏周长为200 ms后，起搏组和药物组在起搏48 h后AERP分别平均缩短32.88 ms 和15.00 ms，见表1、2。

表1各组在不同起搏时点AERP150的变化

Table 1.Change of AERP150 at different points in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO0100.25±2.3799.62±6.5899.75±3.918100.87±5.3093.13±5.46▲95.62±3.3716100.02±2.8287.62±6.11▲93.55±3.33*2498.37±4.7184.87±4.54▲91.00±3.38*3299.00±4.5380.25±4.23▲88.00±4.03*4099.47±4.7277.50±4.62▲85.75±4.39*4899.37±2.8775.25±4.33▲84.75±4.46*

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

表2各组在不同起搏时点AERP200的变化

Table 2.Change of AERP200 at different points in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO0110.62±2.82110.75±5.99112.50±3.928114.25±5.59103.00±5.78▲108.12±3.09▲16112.75±3.80103.50±5.39▲105.12±3.79*▲24111.25±4.1692.12±5.02▲102.62±3.11*▲32112.00±3.7486.37±5.12▲99.25±4.26*▲40111.87±4.9683.00±5.45▲95.75±4.65*▲48112.62±1.8479.75±4.80▲94.25±4.74*▲

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

3频率适应性的变化

心房快速起搏前各组间心房频率适应性的差异无统计学显著性，快速起搏后ATP组的频率适应性降低最明显，随起搏时间延长降低幅度依次增大(P<0.05)，而药物组频率适应性变化缓慢，起搏40 h前与NP组比较差异无统计学显著性，见表3。

表3不同刺激周长下心房频率适应性的变化

Table 3.Change of the adaption of AERP at different cycle lengths in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO012.75±1.4812.50±1.1912.75±0.88813.37±1.0610.37±1.06▲12.50±1.19*1612.75±1.288.50±0.92▲11.62±1.18*2412.87±1.127.25±1.03▲11.62±1.06*3213.00±0.926.12±1.12▲11.25±1.48*4012.87±1.125.50±1.06▲10.01±1.06*▲4813.25±1.164.50±0.92▲9.50±0.92*▲

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

4心房大小和心功能的变化

心房快速起搏前各组心脏超声指标之间的差异无统计学显著性，起搏48 h后复查心脏超声，起搏组和药物组LAD较起搏前增大(P<0.05)，但两组之间差异无统计学显著性。3组LVEDD、 LVESD和 LVEF无明显变化，见表4。

表4快速起搏前后心脏超声指标的变化

Table 4.Comparison of ultrasonic cardiogram indicators before and after tachypacing (Mean±SD.n=8)

GroupLAD(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)BeforeATP NP9.32±0.7713.27±0.878.30±0.4072.41±2.76 ATP9.42±1.3013.34±1.158.35±0.6172.05±3.83 ATO9.56±0.9913.10±0.848.40±0.6069.66±3.65AfterATP NP9.41±0.7713.36±0.728.35±0.4171.81±0.65 ATP11.25±1.19▲13.54±1.118.52±0.6171.00±3.05 ATO10.93±0.86*13.25±0.968.41±0.6170.35±3.89

▲P<0.05vsATP (before ATP);*P<0.05vsATO (before ATP).

5钙离子通道和钾离子通道蛋白表达的变化

起搏48 h后，测量3组CaLα1和Kv4.3的蛋白表达水平，起搏组和药物组表达均下降，但起搏组下降更明显(P<0.05)。两种目的蛋白表达和内参照β-actin蛋白表达量与理论灰度值相符，见图1。

Figure 1.The expression of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3. Mean±SD.n=8.▲P<0.05vsNP group;*P<0.05vsATP group.

图1L型钙离子通道α1亚型蛋白和钾离子通道Kv4.3蛋白表达检测结果

讨　　论

Wijffels等[1]于1995年利用快速起搏心房的方式成功制作了山羊房颤模型，发现随着起搏时间延长AERP逐渐缩短，心房频率适应性降低，证实了电重构参与房颤过程。并提出电重构的结果使房颤趋于自我维持的状态，即房颤触发房颤。电重构的特征主要包括：心房有效不应期缩短、频率适应性降低、心房肌有效不应期离散度增加、心房传导速度减慢、房颤易感性增加等。Yeh等[2]将起搏电极置于犬右心耳，以400 bpm快速起搏心房，分别测定起搏0 d、2 d、4 d、7 d时不同基础起搏周长下的AERP，结果发现在起搏2 d后心房ERP大幅度降低，起搏4 d后ERP下降至基本稳定状态，诱发房颤的持续时间由起搏前(10±7) s 延长至起搏后的数百秒，证明快速激动心房可引起电重构。另有研究[3]进一步评定了心房电重构发生的时限问题，发现房颤患者心房颤动超过10 min即可发生AERP的变化，但房颤终止后可迅速恢复。本研究结果显示快速起搏心房8 h后测定不同基础起搏周长下的AERP均显著缩短，提示房颤模型制作成功。进一步延长起搏时间发现48 h内起搏组AERP在200 ms、150 ms的基础起搏周长下持续降低，与起搏时间具有明显正相关性，心房频率适应性功能随之恶化。

目前，国内外基于他汀类药物的多效性，尤其是在房颤的上游治疗中的作用进行了部分研究。ARMYDA-3研究首次证实择期心脏手术前1周给予ATO可显著减少术后新发房颤，使房颤发生危险降低61%并缩短住院时间[4]。但是有荟萃分析[5]称他汀并不能降低电复律和药物复律后的房颤复发。本研究中ATO预处理组可显著抑制AERP的降低，并在一定程度上改善心房频率适应性不良，有效改善心房电重构。在细胞水平上即表现为心房肌细胞上离子电流的变化，主要涉及L型钙离子通道介导的ICaL和钾离子通道介导的Ito，二者构成动作电位平台期，参与细胞复极过程。已有研究指出细胞内钙超载是诱发心房电重构的始动因素，并且可通过触发负反馈机制,使得钙离子通道失活,从而减少L 型钙通道电流的电流密度,发生心房电重构和兴奋收缩耦联障碍[6]。Christian等[7]应用地高辛增加细胞内钙离子浓度后，AERP降低程度明显高于对照组，证实钙超载是电重构的关键因素。细胞电生理研究发现在快速心房刺激模型中Ito电流密度明显减少，起搏24 h后Ito和Kv4.3蛋白表达下降，同时进一步研究发现Ito在短期起搏后降低，但是长时间起搏后电流强度可逐渐恢复与对照组无明显差异。Bosch 等[8]提出Kv4.3蛋白表达下降可能是Ito电流减少的可能机制，但并不是唯一机制，因为电流减少程度较蛋白表达下降更明显。我们的研究应用Western blot法检测左心房组织中L型钙离子通道蛋白α1亚型CaLα1和钾离子通道蛋白亚型Kv4.3，结果发现心房快速起搏48 h后组织中2 种蛋白含量明显降低，而预先给ATO组可有效抑制通道蛋白表达量下降，且与心脏大小和心功能无关。

大量研究显示炎症、氧化应激是房颤发生的关键因素。动物房颤模型和临床房颤患者的血清、心肌组织中炎性标志物均增加，实验性抗炎治疗有效。Pena等[9]报道C反应蛋白水平升高的患者随机应用瑞舒伐他汀和安慰剂治疗，瑞舒伐他汀组可明显降低房颤风险。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是氧化应激的重要标志物，研究发现房颤发生时NOX2/4活性增加，成为ROS的重要来源[10]。同时房颤导致线粒体发生肿胀、功能障碍，也可产生ROS。目前已有研究显示ROS可直接或者间接调节细胞膜上的离子通道[11]，使钙离子内流增加，导致钙超载，因此抗氧化应激治疗可减少钙超载状态、预防心房电重构[12]，而应用他汀治疗可明显降低ROS生成[13]，改善氧化应激状态。另外他汀类药物可通过调节细胞外金属蛋白酶或其抑制剂的表达改善细胞外基质[14]，进而抑制房颤进展。

总之，本实验发现，ATO预处理可明显改善快速心房起搏诱导的兔心房电重构，进一步研究发现ATO可在一定程度上抑制心房肌钾、钙离子通道蛋白水平降低，这可能为ATO改善心房电重构的离子机制之一。ATO作为治疗房颤的非传统抗心律失常药物有良好的应用前景。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effect of atorvastatin applied to atrial tachypacing rabbits on electrical remodeling

SONG Xue-lian, QI Xiao-yong, DANG Yi, LI Ying-xiao, YANG Qian

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:hbghxiaoyong_q@126.com)

AIM: To investigate the effect of atorvastatin (ATO) on electrical remodeling, atrial ion channel protein expression and cardiac function in atrial tachypacing rabbits, and to explore the potential electrical mechanism of ATO in the prevention of atrial fibrillation. METHODS: The rabbits were subjected to atrial tachypacing at 600 min-1in the absence or presence of treatment with atorvastatin (ATP and ATO groups) for 48 h, and the other 10 as sham group without pacing (NP group). The tachypacing model was performed by attaching pacing and testing electrodes to left atrial and connecting with custom animal cardiac pacemaker in the open-chest situation. The animals in ATO group were pretreated with ATO for 7 d and continued during tachypacing. Serial atrial effective refractory period (AERP) was measured in each rabbit at baseline， 8 h, 16 h, 24 h, 32 h, 40 h and 48 h with different cycle lengths. The changes of cardiac functions and cardiac structure were observed by cardiac ultrasonic cardiogram before and after atrial tachypacing. The expression of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3 was detected by Western blotting. RESULTS: Compared with NP group, AERP at cycle lengths of 150 and 200 ms, the adaption of AERP, and the levels of CaLα1 and Kv4.3 expression were all decreased in ATP and ATO group, especially in ATP group. Left atrial dimension (LAD) was increased in pacing groups as compared with NP group (P<0.05) after pacing delivery for 48 h, while no difference between the formers was observed. No significant change of the left ventricular dimension (LVD) and ejection fraction (LVEF) among groups before and after pacing was found. CONCLUSION: Atrial tachypacing significantly shorten AERP, resulting in poor adaption of AERP, while ATO pretreatment significantly attenuates the atrial electrical remodeling in rabbits, but had no effect on cardiac structure. ATO suppresses the down-regulation of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3 expression after 48 h, which may be the potential ionic mechanism of atrial electrical remodeling for ATO.

Atrial fibrillation; Atorvastatin; Electrical remodeling

1000- 4718(2016)04- 0623- 05

2015- 11- 09

2016- 01- 25

Tel: 0311-85988937; E-mail: hbghxiaoyong_q@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.008

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