李兆欣，　刘江月，　王其新△

(1青岛大学附属医院, 山东 青岛 266000； 2潍坊医学院病理生理教研室， 山东 潍坊 261053)



Aliskiren抑制LPS诱导HUVECs新生血管的形成及可能机制*

李兆欣1，刘江月2，王其新1△

(1青岛大学附属医院, 山东 青岛 266000；2潍坊医学院病理生理教研室， 山东 潍坊 261053)

目的： 研究阿利吉仑(aliskiren)对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)新生血管形成能力的影响及可能的机制。方法: 常规培养的HUVECs随机分为空白组和肾素组，ELISA法测定炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平， Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)和ICAM-1的蛋白水平。将常规培养的HUVECs随机分为空白对照组、LPS模型组以及aliskiren低剂量(1 μmol/L)、中剂量(10 μmol/L)和高剂量(100 μmol/L)组。MTT法和BrdU法检测HUVECs的增殖能力，Transwell法测定HUVECs的迁移率，以HUVECs在Matrigel胶上形成管腔结构情况来判断其血管形成能力。ELISA测定炎性细胞因子TNF-α、ICAM-1和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的水平，RT-PCR和Western blot 法检测肾素、TLR4、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白水平。结果: 肾素能够刺激HUVECs炎症因子的分泌及TLR4的表达；aliskiren呈浓度依赖性抑制HUVECs增殖、迁移及新生血管形成，降低MCP-1、TNF-α、IL-6水平及肾素、MMP-2、MMP-9的表达，抑制TLR4表达(P<0.05)。结论: Aliskiren能够有效抑制LPS诱导HUVECs新生血管形成能力，可能与其下调肾素表达抑制TLR4途径介导的炎症反应及MMP-2、MMP-9生成有关。

阿利吉伦； 新生血管形成； 炎症反应； Toll样受体 4； 肾素

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的病理生理基础，斑块不稳定与急性心脑血管事件发生密切相关。近年研究证明，斑块内血管新生是衡量斑块稳定性的一项新指标[1]。新生血管可促进炎症细胞聚集，诱发斑块出血和破裂，因此，减少斑块内血管新生、稳定斑块成为防治冠状动脉粥样硬化的治疗靶点。研究发现肾素基因高表达能够使血管炎症因子、黏附分子的基因和蛋白表达增加，加重内皮细胞损伤，使AS斑块不稳定性增加[2-3]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)介导的细胞因子和趋化因子产生增加能刺激细胞的迁移和细胞增殖[4]。TLR4激动还能导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、-9和组织蛋白酶表达增加，这些蛋白酶参与细胞外基质的降解[5]。MMP-2 通过重塑细胞外基质和降解基底膜使内皮细胞从原有血管迁移到外周形成新生血管，最终导致动脉粥样硬化的发生、发展[6]。Celletti等[7]发现，在AS 斑块内MMP-9 的水平与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达呈正相关，提示MMP-9 的水平可能影响斑块内血管生成。阿利吉仑(aliskiren)是近年新发现的肾素抑制剂，具有抗氧化应激和炎症[8]的作用。炎症激活的内皮细胞发生增殖和迁移，能够促进斑块内血管和血管网的形成。本研究以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)为对象，观察aliskiren是否通过下调肾素表达抑制TLR4途径介导的炎症反应及MMP的生成，抑制动脉粥样硬化斑块内新生血管的形成，增强斑块的稳定性，延缓AS的发生发展。

材　料　和　方　法

1材料

1.1细胞株HUVECs购于Thermo Fisher Scienti-fic。

1.2药物与主要试剂Aliskiren(瑞士诺华制药有限公司)；人重组肾素(Cayman)；细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和胰蛋白酶(Sigma)；DMEM 低糖培养基(Gibco)；胎牛血清(HyClone)；Western blot相关试剂以及检测TLR4、MMP-2和MMP-9的RT-PCR试剂盒(碧云天生物技术研究所)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)ELISA试剂盒，肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3主要仪器752型紫外分光光度计(上海精密仪器有限公司)；DYCZ-25D型电泳仪(北京市六一仪器厂)；Bio-Rad 型湿转仪(Bio-Rad)。

2方法

2.1ELISA测定肾素对HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影响将生长良好的HUVECs接种于6孔板，分为空白组、肾素组，肾素组加入10-9mol/L 肾素孵育20 min后，收集上清，采用ELISA试剂盒分别检测TNF-α和ICAM-1的水平。

2.2Western blot 法检测肾素对HUVECs TLR4和ICAM-1蛋白表达的影响细胞处理同ELISA实验，收集细胞后加入细胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离蛋白后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入 I 抗(1∶500)后4 ℃过夜，TBST漂洗后加入 II 抗孵育1 h，化学发光反应，显影定影，图像分析。

2.3MTT法检测Aliskiren对LPS诱导HUVECs活力的影响取对数生长期的HUVECs处理后接种于96孔板，分为空白对照(control)组、LPS(10 mg/L)组以及aliskiren低剂量(low-dose,LD)、中剂量(middle-dose,MD)和高剂量组(high-dose,HD)。LD、MD和HD组分别加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control组外，其余各组加入终浓度10 mg/L的LPS继续培养24 h。换新的培养基，加入MTT(0.5%)，继续培养4 h后，加入150 μL DMSO，用酶标仪490 nm测定吸光度(A)值。

2.4BrdU法检测aliskiren对LPS诱导HUVECs增殖的影响取对数生长期的HUVECs处理后接种于96孔板，低、中和高剂量组分别加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control组外，其余各组加入终浓度10 mg/L的LPS继续培养24 h。换新的培养基，每孔加入BrdU 10 μL，继续培养4 h后，去除BrdU加入FixDenat 200 μL固定细胞30 min。去除FixDenat，每孔加入BrdU-Pod抗体100 μL，常温孵育90 min，洗板3次后每孔加入100 μL底物显色液，孵育20 min后观察颜色变化，用酶标仪490 nm测定吸光度(A)值。

2.5Transwell法测定aliskiren对LPS诱导HUVECs的迁移率将生长良好的HUVECs调整密度为2×109/L。取100 μL 细胞悬液加入Transwell小室上室中，同时低、中和高剂量组分别加入1、10和100 μmol/L aliskiren。下室除control组外，其余各组加入LPS作为刺激剂。培养6 h后，拿出小室，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色30 min，PBS 漂洗3次，去除滤膜上层细胞后，镜下观察细胞迁移情况并拍照。

2.6HUVECs管腔形成实验在24孔板中加入预冷融化的Matrigel胶，37 ℃凝固 1 h，预处理的HUVECs(处理方法同前)以每孔1×104的密度铺于Matrigel胶上，37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养12 h，光镜下观察拍照。

2.7ELISA测定aliskiren对LPS诱导HUVECs的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平将生长良好的HUVECs接种于6孔板，低、中和高剂量组分别加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control组外，其余各组加入终浓度10 mg/L的LPS继续培养24 h，收集上清，采用ELISA试剂盒分别检测TNF-α、ICAM-1、MCP-1水平。

2.8RT-PCR法检测aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达细胞处理同ELISA实验，收集细胞，提取总RNA后合成cDNA，GAPDH为内参照，进行PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件为：94 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min,共30个循环。

表1　引物序列

2.9Western blot 法检测aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白的表达细胞处理同ELISA实验，收集细胞后加入细胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分离蛋白后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入 I 抗(1∶500)后4 ℃过夜，TBST漂洗后加入 II 抗孵育1 h，化学发光反应，显影、定影，图像分析。

3统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。组间比较采用t检验或单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1肾素对HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影响

与空白组比较，肾素组的TNF-α和ICAM-1水平明显升高(P<0.05)，说明肾素可以刺激HUVECs分泌炎症因子，见图1。

Figure 1.The effect of renin on the secretion of TNF-α and ICAM-1 in HUVECs.Mean±SD.n=10.*P<0.05vsblank group.

图1肾素对HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影响

2肾素对HUVECs TLR4和ICAM-1蛋白表达的影响

与空白组比较，肾素组TLR4和ICAM-1蛋白表达均显著升高(P<0.05)，说明肾素可以激活TLR4炎症通路，促进HUVECs炎症因子的表达，见图2。

Figure 2.The effect of renin on the expression of TLR4 and ICAM-1 proteins in HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsblank group.

图2肾素对HUVECs分泌TLR4、ICAM-1蛋白表达的影响

3Aliskiren对LPS诱导HUVECs增殖的影响

MTT和BrdU结果显示，与空白对照组比较，LPS模型组细胞的增殖明显增强(P<0.05)；与LPS模型组比较，aliskiren低、中、高剂量各组细胞的增殖明显受抑制(P<0.05)；与aliskiren中剂量组比较，低剂量组的细胞增殖抑制作用明显减弱(P<0.05)，高剂量组的细胞增殖抑制作用明显增强(P<0.05)，说明aliskiren对LPS诱导HUVECs增殖呈明显剂量依赖性抑制作用，见图3、4。

Figure 3.The effect of aliskiren on the viability of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图3Aliskiren对LPS诱导HUVECs活力的影响

4Aliskiren对LPS诱导HUVECs迁移的影响

与空白对照组比较，LPS模型组HUVECs的迁移能力明显增强，细胞迁移数量明显增多，而aliskiren低、中、高剂量组加入不同浓度aliskiren干预后细胞

Figure 4.The effect of aliskiren on the proliferation of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图4Aliskiren对LPS诱导HUVECs增殖的影响

迁移的数量明显减少(P<0.05)；且与aliskiren中剂量组比较，低剂量组细胞迁移的数量明显增多(P<0.05)，高剂量组细胞迁移的数量明显减少(P<0.05)，表明 LPS 对 HUVECs 有很强的诱导迁移作用，而aliskiren呈浓度依赖性抑制了其诱导迁移的能力，见图5。

5Aliskiren对LPS诱导HUVECs管腔形成的影响

空白对照组HUVECs多形成条索状或不连续小管样结构，完整小管形成数量少；与空白对照组比较，LPS模型组小管形成数量明显增加；与LPS模型组比较，不同浓度的aliskiren干预对HUVECs小管形成有明显浓度依赖性抑制作用(P<0.05),见图6。

Figure 5.The effect of aliskiren on the migration of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图5Aliskiren对LPS诱导HUVECs迁移的影响

6Aliskiren对LPS诱导HUVECs分泌TNF-α、ICAM-1和MCP-1的影响

与空白对照组比较，LPS模型组的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明显升高(P<0.05)；与LPS模型组比较，aliskiren低、中、高剂量各组的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平均明显减少(P<0.05)；与

Figure 6.The effect of aliskiren on the capillary-like tube formation of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图6Aliskiren对LPS诱导HUVECs管腔形成的影响

aliskiren中剂量组比较，低剂量组的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明显升高(P<0.05)，而高剂量组的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明显降低(P<0.05)，说明aliskiren呈明显浓度依赖性抑制LPS诱导HUVECs的TNF-α、ICAM-1和MCP-1分泌，见图7。

Figure 7.The effect of aliskiren on the secretion of TNF-α, ICAM-1 and MCP-1 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图7Aliskiren对LPS诱导HUVECs分泌TNF-α、ICAM-1和MCP-1的影响

7Aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9 mRNA表达的影响

与空白对照组比较，LPS模型组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达均显著升高；与LPS模型组比较，aliskiren低、中和高剂量各组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达均明显减少(P<0.05)；与aliskiren中剂量组比较，低剂量组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达明显升高(P<0.05)，而高剂量组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达明显降低(P<0.05)，说明aliskiren呈明显浓度依赖性抑制LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表达，见图8。

8Aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

与空白对照组比较，LPS模型组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著升高；与LPS模型组比较，aliskiren低、中和高剂量各组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均明显减少(P<0.05)；与aliskiren中剂量组比较，低剂量组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达明显升高(P<0.05)，而高剂量组肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达明显降低(P<0.05)，说明aliskiren呈明显浓度依赖性抑制LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达，见图9。

讨　　论

AS是一种严重威胁人类健康的常见病、多发病。研究认为AS是由多种致病因素引起的以内皮细胞损伤为基础、以血管的慢性炎症为特征的病理过程。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)由一系列酶、肽类、激素及其受体所组成，在AS发生发展过程中起重要作用。肾素是肾素原在激活酶催化作用下生成的一种蛋白酶，是血管紧张素(angiotensin，Ang)II上游的RAS成员。研究发现肾素基因高表达能够促进动脉粥样硬化的发生发展。肾素高表达，通过激活RAS使Ang I和Ang II生成增多，而Ang原生成减少，进而使血管炎症因子、黏附分子的基因和蛋白表达增加；增多的Ang II进一步加重内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖等的炎症反应。本研究发现肾素能够通过TLR4途径促进HUVECs炎症因子的分泌与表达，LPS诱导的HUVECs肾素表达明显增高，TLR4及炎症因子表达明显增高，提示LPS诱导的HUVECs炎症反应可能是上调肾素高表达后，通过TLR4途径促进HUVECs炎症因子的分泌与表达。

Figure 8.The effect of aliskiren on the mRNA expression of renin, TLR4, MMP-2 and MMP-9 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图8Aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9 mRNA表达的影响

AS不稳定斑块形成，甚至斑块破裂，是引发急性冠状动脉综合症等临床严重并发症的主要病理学基础[9]。而不稳定斑块的重要特征之一就是斑块内血管新生。血管新生是通过血管内皮细胞的增殖和迁移，从先前存在的血管处以芽生或者非芽生的形式形成新的血管的过程，主要分为内皮细胞增殖、迁移、管腔形成3个阶段。斑块内的新生血管无平滑肌支持，管壁薄弱，易于引起斑块不稳定、斑块内出血,甚至斑块破裂。Moulton 等[10]的研究证实，血管生成抑制药物可以抑制动脉粥样硬化病灶内新生血管的形成，稳定斑块、减缓斑块的发展。Aliskiren是新发现的肾素抑制剂，在动脉粥样硬化和冠心病的治疗中具有重要意义[11-12]。HUVECs 是研究血管新生的主要细胞，故本研究通过观察aliskiren对HUVECs的增殖、迁移及管腔形成能力来评价aliskiren对新生血管形成的抑制作用。研究结果表明，aliskiren呈浓度依赖性抑制HUVECs增殖、迁移及新生血管形成。

Ross[13]认为，炎症反应存在于动脉粥样硬化发生、发展的每一个环节。研究表明，炎症反应也是引起动脉粥样硬化斑块内血管新生的主要原因之一。

Figure 9.The effect of aliskiren on the protein expression of renin, TLR4, MMP-2 and MMP-9 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

图9Aliskiren对LPS诱导HUVECs肾素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

LPS是实验中最常用的经典炎症刺激因子，可通过激活TLR4传导途径激活内皮细胞，介导趋化因子、炎症因子等的表达。本研究以LPS作为炎症刺激物，观察TLR4传导途径激活对新生血管形成的影响，探讨aliskiren抑制新生血管形成的机制。研究结果表明，aliskiren呈浓度依赖性抑制TLR4表达及TNF-α、ICAM-1和MCP-1等炎症因子的分泌，说明aliskiren可能通过抑制TLR4传导途径激活减轻炎症反应，从而抑制新生血管的形成，稳定斑块。

斑块内细胞外基质的代谢情况是影响动脉粥样斑块稳定性的又一个重要因素。基质金属蛋白酶家族是影响基质分解的关键因子。AS病变时，被激活的内皮细胞以及单核-巨噬细胞均可分泌MMP-2、MMP-9及VEGF等，刺激新生血管内皮细胞增殖、迁移而加快血管新生，另一方面，基质金属蛋白酶通过降解基底膜和重塑细胞外基质使内皮细胞从原有血管迁移到外周形成新生血管[14]。有研究将HUVECs培养于基膜样物质上时，内皮细胞很快排成直线，围成管状，用明胶酶谱分析，上清液中检测出大量活化的MMP-2 和MMP-9，说明MMP-2、MMP-9与新生血管的形成有密切的关系[15]。本研究结果表明，aliskiren呈浓度依赖性抑制MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白的表达，说明aliskiren可能通过抑制MMP-2、MMP-9的表达，抑制新生血管的形成，稳定斑块。

综上所述，本研究发现肾素在动脉粥样硬化发生发展过程中的可能作用，aliskiren通过下调肾素表达抑制TLR4途径介导的炎症反应及MMP的生成，抑制动脉粥样硬化斑块内新生血管的形成，增强斑块的稳定性，为动脉粥样硬化的防治提供新的治疗靶点和理论依据。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Inhibitory effect of aliskiren on LPS-induced angiogenesis of HUVECs

LI Zhao-xin1, LIU Jiang-yue2, WANG Qi-xin1

(1TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266000,China;2DepartmentofPathophysiology,WeifangMedicalCollege,Weifang261053,China.E-mail:lilyzx@163.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of aliskiren on the angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by lipopolysaccharide (LPS) and to explore its possible mechanism. METHODS: HUVECs were cultured and randomly divided into blank group and renin group. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the culture supernatant were detected by ELISA. The protein levels of Toll-like receptor 4 (TLR4) and ICAM-1 in the HUVECs were determined by Western blot. HUVECs were cultured and randomly divided into control group, LPS group, low-dose (1 μmol/L) aliskiren group, middle-dose (10 μmol/L) aliskiren group and high-dose (100 μmol/L) aliskiren group. The proliferation of HUVECs was detected by MTT and BrdU assays. The mobility of HUVECs was measured by Transwell assay. The formation of the vessels was judged by observing the formation of the luminal structure by HUVECs in Matrigel. The levels of TNF-α, ICAM-1 and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) in the culture supernatant were measured by ELISA. The expression of renin, TLR4, matrix me-talloproteinases-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) at mRNA and protein levels in the HUVECs was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: Renin stimulated the expression of inflammatory factors and TLR4 in the HUVECs. Aliskiren inhibited the growth, migration and angiogenesis of HUVECs in a dose-dependent manner, decreased the levels of TNF-α, ICAM-1 and MCP-1 and the expression of renin, MMP-2 and MMP-9, and inhibited TLR4 expression (P<0.05).CONCLUSION: Aliskiren inhibits LPS-induced angiogenesis of HUVECs, which may be related to the down-regulation of renin expression, the inhibition of TLR4-mediated inflammatory reaction, and the formation of MMP-9 and MMP-2.

Aliskiren; Angiogenesis; Inflammation; Toll-like receptor 4; Renin

1000- 4718(2016)04- 0602- 08

2015- 07- 27

2016- 03- 14

山东省中医药管理局资助项目(No.2013-237)； 青岛市民生计划项目(No.13-1-4-139-jch)

Tel: 0532-82911619； E-mail: lilyzx@163.com

R972.6; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.005

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