许丽娟，陈 薇，吴迎奔，王 震，汪 彬，贺月林

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

亚硝酸盐降解菌N419的培养基优化

许丽娟，陈 薇，吴迎奔，王 震，汪 彬，贺月林

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

为了规模化生产和实际应用亚硝酸盐降解菌N-419，对其发酵培养基进行了优化，选出由单因素试验确定的营养物质（玉米淀粉、工业蛋白胨）以及CaCl2和MnSO4，进行4因素3水平的正交试验。结果表明：N-419菌株的最佳培养基配方为玉米淀粉20 g/L、工业蛋白胨10 g/L、CaCl 0.3 g/L、MnSO 0.2 g/L、KHPO 0.12 g/L、KHPO 0.25 g/L，其芽孢数可达1.44×1010CFU/m L。

亚硝酸盐降解菌；枯草芽孢杆菌；培养基优化

随着我国规模化、高密度水产养殖业的迅速发展，鱼食料及肥料投放量日益增加，养殖水体中各类有机污物随之增加，进而引起水体富营养化，造成水体中氮素过剩，亚硝酸盐含量超标，养殖生态环境遭到严重破坏［1-3］。据报道，养殖水体中亚硝酸盐含量过高可削弱养殖动物的抗病能力，影响养殖动物的生长，甚至可使养殖动物死亡［4］，给水产养殖业造成重大损失。因此，如何有效地降低养殖水体中亚硝酸盐的含量，净化水环境成为人们关注的焦点问题。

为了减轻亚硝酸盐污染带来的危害，在养殖过程中常采用曝气、增氧、投加微生物制剂等方法进行预防。其中，投加微生物制剂法具有效果明显、价格低廉的优点，且无毒副作用、无残留、不产生抗药性，深受广大用户的青睐［5-6］。

芽孢杆菌（Bacillus）能促进水生动物对营养物质的吸收，增强其消化机能，同时还能减少水体中的亚硝酸盐和H2S等有害物质，促进水环境生态良性循环，已在水产养殖中广泛应用［7］。研究以前期筛选纯化的高效降亚硝酸盐的枯草芽孢杆菌N-419为材料，通过单因素试验和正交试验初步优化其发酵培养基，旨在为该菌的规模化生产和实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌 种 枯草芽孢杆菌N419，由湖南省微生物研究院环保微生物室自行分离和保存。

1.1.2 培养基 种子及斜面保存培养基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0于0.1 MPa灭菌20 m in。在此培养基中添加2.0%的琼脂制成固体培养基。基础发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。培养基优化时按试验设计方案调整各组成成分。

1.1.3 培养条件 种子培养条件：从斜面挑取一接种环菌苔于100 m L种子培养基中，于37℃，180 r/min恒温摇床振荡培养10 h。发酵培养条件：在500 mL三角瓶中装入基础发酵培养基100 m L，接种量3%，于37℃，180 r/m in恒温摇床振荡培养24 h。

1.2 培养基的优化

1.2.1 碳、氮源试验 以基础发酵培养基为基础，分别用10 g/L葡萄糖、淀粉、蔗糖和玉米淀粉作唯一碳源，其他组分不变，制成培养基。通过检测各处理活菌数和芽孢数，以确定最佳碳源。确定碳源以后，分别以10 g/L牛肉膏、尿素、酵母膏、工业蛋白胨为唯一氮源进行发酵培养，确定培养基中的最佳氮源。

1.2.2 正交试验 通过单因素实验，以芽孢杆菌芽孢数为指标，选择酵母膏和玉米淀粉作为氮源和碳源，CaCl2和MnSO4为无机盐，每个因素分别选择3个水平，设计正交试验（表1），用L9（34）正交表对各组分进行优化试验。每组实验设3个平行，500 mL三角瓶装液量100 m L，最佳发酵条件，培养24小时测定芽孢数。

表1 芽孢杆菌N419发酵培养基正交试验设计（g/L）

1.3 细菌总数和芽孢总数的测定

采用结晶紫染色法确定发酵液的芽孢产率，用血球计数板测得细菌浓度，由此计算可得芽孢数。

1.4 数据分析

试验数据运用SPSS 13.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 碳 源

从图1中可以看出，不同碳源对枯草芽孢杆菌发酵菌数和芽孢数有不同的影响。其中，以玉米淀粉作碳源时枯草芽孢杆菌菌体数和芽孢数最高，分别为8.2×109和6.9×109CFU/mL，因此选择玉米淀粉作为枯草芽孢杆菌培养基碳源成分。

图1 不同碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响

2.2 氮 源

由图2可知，枯草芽孢杆菌在含有牛肉膏、酵母膏、工业蛋白胨的培养基中活菌数、芽孢数不存在显著差异，尿素作为氮源时的菌体数和芽孢数远低于其他氮源。由于工业蛋白胨容易获得，原料价格低廉，因此选用工业蛋白胨作为氮源使用。

2.3 正交试验结果

图2 不同氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响

由表2的极差分析可看出，影响菌株N-419发酵水平的主次因素关系为：玉米淀粉＞工业蛋白胨＞MnSO4＞CaCl2，因素间最佳水平组合为A2B2C1D3。结合无机盐的筛选结果，添加其他两种可以提高发酵水平的无机盐，枯草芽孢杆菌N-419的最佳发酵培养基配方为：玉米淀粉20 g/L，工业蛋白胨10 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，K2HPO40.12 g/L，KH2PO40.25 g/L。在此条件下，枯草芽孢杆菌的发酵芽孢数可达1.44× 1010CFU/mL。从表3可以看出，F玉米淀粉=60.499＞F0.05（2，2）=19.00，F工业蛋白胨=43.128＞F0.05（2，2）=19.00，FMnSO4=33.977＞F0.05（2，2）=19.00，说明玉米淀粉、工业蛋白胨和MnSO4的作用均达到显著水平，这3种因素在发酵过程中对枯草芽孢杆菌N-419的生长起着关键作用。

表2 枯草芽孢杆菌培养基浓度的正交试验结果

表3 枯草芽孢杆菌正交试验方差分析

3 结论与讨论

亚硝酸盐是氮素循环过程细菌硝化与反硝化过程中重要的中间产物。水体中的亚硝酸盐是鱼、虾养殖研究通过单因素和正交试验初步优化了枯草芽孢杆菌N-419的发酵培养基，为规模化生产奠定基础。综合考虑其投入产出比，适合工业化发酵与否，优选来源容易、价格低廉、菌数和芽孢数高的玉米淀粉作为培养基的碳源成分，工业蛋白胨作为培养基的氮源成分。对发酵培养基组分含量进行正交试验，枯草芽孢杆菌N-419的最佳发酵培养基配方为：玉米淀粉20 g/L，工业蛋白胨10 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，K2HPO40.12 g/L，KH2PO40.25 g/L。在此条件下，枯草芽孢杆菌的发酵芽孢数可达1.44×1010CFU/mL。

过程中的重要危害因素之一［8］。当水体中亚硝酸盐浓度累积到0.1 mg/L后，亚硝酸盐可通过水产动物的鳃和体表进入其血液，与血液中的携氧蛋白结合，使血液失去携氧功能，从而水产动物出现食量下降、呼吁困难、鳃部受损等症状。若长时间生活在亚硝酸盐浓度较高的环境下，水产动物的活力变差，自身免疫力也下降，易爆发各种疾病［9］。而微生态制剂可有效分解、合成或转化水体中的有害物质，从而净化水质，调节水体环境［10］。据报道，枯草芽孢杆菌能有效调节养殖环境，净化水质，减少换水次数，大大节约养殖成本。同时，该菌还可减少抗生素的使用，提高水产品品质［11］。

［1］ 刘德生，史彩华，李志新. 降解养殖水体亚硝酸盐的研究进展和前景分析［J］. 现代农业科学，2009，16（4）：14-15.

［2］ 徐霞旭，周永灿，郑 兴，等. 一株高效水质改良菌的筛选鉴定及其作用效果研究［J］. 水产科学，2014，33（4）：231-236.

［3］ 田 彬. 养殖水体中亚硝酸盐的危害及控制［J］. 渔业致富指南，2008，（15）：57.

［4］ 周冬仁，沈锦玉，潘晓艺，等. 一株亚硝酸盐降解菌的分离鉴定［J］.农学学报，2011，（2）：49-53.

［5］ 王会聪，曹海鹏，何 珊，等. 一株亚硝酸盐降解菌的分离鉴定与系统发育分析［J］. 环境污染与防治，2012，34（4）：32-36.

［6］ 王 艳. 芽孢杆菌在养殖生态系统中的作用［J］. 呼伦贝尔学院学报，2015，23（2）：109-116.

［7］ 洪徐鹏，段燕君，周佳楠，等. 微生态制剂在改善水产养殖动物免疫力中的应用［J］. 安徽农业科学，2014，42（22）：7431-7434.

［8］ 宋 蓉，许春苹，梁运祥. 一株干酪乳杆菌对养殖水体亚硝酸盐去除机理的研究［J］. 淡水渔业，2013，43（1）：3-8.

［9］ 宋余凤，杨宝圣. 亚硝酸盐在水产养殖中的危害及解决方法［J］. 科学养鱼，2010，（7）：16.

［10］ 袁科平，邹世平，李 谷，等. 一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化［J］. 福建农林大学学报（自然科学版），2011，40（1）：69-73.

［11］ 尹文林，沈锦玉，沈智华，等. 枯草芽孢杆菌B115株对水质改良效果研究［J］. 渔业现代化，2006，（6）：9-11，20.

（责任编辑：成 平）

Optim ization of Culture Media for A Bacillus Subtilis of Degrading Nitrite

XU Li-juan，CHEN Wei，WU Ying-ben，WANG Zhen，WANG Bin，HE Yue-lin
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to use nitrite degrading bacteria N-419 in scale production， ed its culture medium was optim ized. According to the results of single factor orthogonal test for culture optimization， the orthogonal experiment with 4 factors （corn powder， industrial peptone, CaCl2， MnSO4） and 3 levels was carried out. The results showed that optimal medium was as follows： corn powder 20 g/L， industrial peptone 10 g/L， CaCl20.3 g/L， M nSO4 0.2 g/L， K2HPO40.12 g/L， KH2PO40.25 g/L， respectively. Under the conditions， 1.44×1010CFU bacteria per m illiliter were obtained.

nitrite； Bacillus subtilis； medium optimization

Q939.96

A

1006-060X（2016）09-0010-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.004

2016-07-05

湖南省科技计划（2015CK3008）

许丽娟（1980-），女，湖南岳阳市人，高级农艺师，主要从事环境微生物研究。

贺月林

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